[发明专利]MSP纳米微孔和相关方法

说明书

交叉参考相关申请

本申请要求2008年9月22日提交的美国临时申请系列案61/098,938的权益，所述临时申请系列案以其全文通过引用合并入本文。

政府许可权利的声明

本发明是利用在由国立卫生研究院授予的基金号5R21HG004145下的政府资助进行的。政府在本发明中具有某些权利。

背景

已建立的DNA测序技术需要大量DNA和若干冗长的步骤来仅构建全长序列的数十个碱基。然后必须以“鸟枪法”方式(非线性地依赖于基因组的大小和依赖于从其构建全长基因组的片段的长度的工作)装配该信息。这些步骤很昂贵且费时，尤其当测定哺乳动物基因组的序列时。

概述

本文中提供了包括对具有界定通道(tunnel)的前厅(vestibule)和缢缩区(constriction zone)的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白施加电场的方法，其中Msp孔蛋白位于第一导电液体介质与第二导电液体介质之间。

还提供了改进通过Msp孔蛋白的通道(tunnel)的电导的方法，包括除去、添加或置换野生型Msp孔蛋白的前厅或缢缩区中的至少一个氨基酸。

还提供了包括具有界定通道的前厅和缢缩区的Msp孔蛋白的系统，其中所述通道位于第一液体介质与第二液体介质之间，其中至少一种液体介质包含分析物，以及其中系统对于检测分析物的性质是有效的。

还提供了包括具有界定通道的前厅和缢缩区的Msp孔蛋白的系统，其中所述通道位于第一液体介质与第二液体介质之间的脂双层中，并且其中第一与第二液体介质之间的液体连通的唯一点存在于通道中。

还提供了突变的Msp孔蛋白。例如，提供了突变的耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，其包含界定通道的前厅和缢缩区，以及至少第一突变MspA单体，所述单体包含位置93上的突变和位置90、位置91或位置90及91上的突变。还提供了突变的MspA孔蛋白，其包含具有约2至约6nm的长度和约2至约6nm的直径的前厅，和具有约0.3至约3nm的长度和约0.3至约3nm的直径的缢缩区，其中所述前厅和缢缩区一起界定了通道，以及还包含至少第一突变MspA旁系同源物或(paralog)同系物(homolog)单体。还提供了突变MspA旁系同源物或同系物，其包含具有约2至约6nm的长度和约2至约6nm的直径的前厅，和具有约0.3至约3nm的长度和约0.3至约3nm的直径的缢缩区，其中所述前厅和缢缩区一起界定了通道。

描述了产生突变的Msp孔蛋白的方法。例如，本文中提供了产生突变的MspA孔蛋白的方法，包括在位置93上和位置90、位置91或位置90及91上修饰野生型MspA单体。还提供了产生具有界定了通道的前厅和缢缩区的突变MspA孔蛋白的方法，包括在野生型MspA旁系同源物或同系物单体的前厅或缢缩区中缺失、添加或置换任何氨基酸以便所得的突变MspA孔蛋白能够在施加电场后将分析物转位通过通道。

还提供了一种方法，所述方法包括在不使用电场的情况下使分析物转位通过耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)孔蛋白的通道。

本文中提供了核酸序列。任选地，核酸序列可包含第一和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码第一Msp单体序列并且第二核苷酸序列编码第二Msp单体序列。该核酸序列还可包含编码氨基酸连接体序列的第三核苷酸序列。任选地，该核酸序列还包含编码第三或更多Msp单体序列的第三或更多核苷酸序列。例如，所述核酸序列还可包含第3、第4、第5、第6、第7和第8核苷酸序列。所述第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8核苷酸序列编码第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8Msp单体序列，并且该核酸序列还包含编码氨基酸连接体序列的第9核苷酸序列。还提供了包含两个或更多个单链Msp的Msp孔蛋白。

还提供了由本文中所述的核酸编码的多肽。还提供了包含本文中描述的多肽的载体。还提供了用本文中描述的任何载体转染的培养细胞或其后代，其中所述细胞能够表达Msp孔蛋白或Msp孔蛋白单体。还提供了包含本文中描述的任何载体的耻垢分枝杆菌菌株。

还提供了能够诱导Msp单体表达的突变的细菌菌株，所述细菌菌株包含：(a)野生型MspA的缺失；(b)野生型MspC的缺失；(c)野生型MspD的缺失；和(d)包含有效地连接于Msp单体核酸序列的诱导型启动子的载体。