[发明专利]包含多个同源核苷酸序列的载体

说明书

背景技术

核酸的同源重组现象涉及同源序列内核酸链的物理断裂和交叉再连接。许多研究组研究了哺乳动物细胞内的重组和基因转换，这些研究组监测了用适当构建的病毒或质粒物质感染后的选择性基因的重建(Chakrabarti et al.，Mol.Cell.Biol.6：2520-2526，1986)。这些实验的结果表明，细胞有效地支持分子内和分子间重组和基因转换。(同上)。分子间重组是指在两个不同核酸分子上存在的同源序列之间的重组，而分子内重组是指在单个核酸分子上存在的同源序列之间的重组。

分子间重组可以在质粒或病毒中的基因与细胞内的同源序列之间发生。(Miller et al.，Mol.Cell.Biol.6：2895-2902，1986)。这种类型的重组可以导致从减毒病毒产生传染性病毒。Fuller等人对HIV-1 gag和HIV-1 pol基因的分离序列进行了密码子优化，以提高其在哺乳动物细胞内的表达。这些优化还降低了存在于HIV的gag-pol基因内约200个碱基对的重叠区中核苷酸的同一性，这还引起了在置于两个独立质粒上的gag和pol开放阅读框与在重组逆转录病毒载体内包含的截短gag基因之间的分子间重组水平的降低。(Fuller et al.，Hum.Gene Ther.12：2081-2093，2001)。

分子内重组可以利用载体发生，在所述载体中存在基因或基因片段的重复化区域，该区域作为被插入序列隔开的直接重复。这种类型的重组通常导致插入序列的缺失和一个拷贝的重复序列。分子内重组的频率通常远高于分子间重组。

已经在哺乳动物细胞内对质粒载体内的分子内重组水平进行了量化。(Rubnitz and Subrami，Mol.Cell.Biol.4：2253-2258，1984)。与同源区域的大小有关，所转染的质粒DNA内的分子内重组频率为0.306％-0.002％。(同上)。利用小至14个碱基的同源性观察到低重组效率。(同上)。

同源序列之间的分子内重组还在包括细小核糖核酸病毒、流感病毒、腺病毒和痘病毒的多个动物病毒中有记载。(Gritz et al.，J.Virol.64：5948-5957，1990)。已经证明，在牛痘病毒中随机重复序列在遗传上不稳定。(同上)。在病毒中，已经发现分子内重组的水平远高于在质粒载体中的观察结果。

例如，在逆转录病毒中，发现同一RNA分子中两个相同序列之间的重组频率为约62％。(Zhang et al.，J.Virol.75：6348-6358，2001)。相对于分子间重组(两个RNA分子之间)，这些重组的99％为分子内重组(一个RNA分子上的两个序列之间)。(同上)。利用腺相关病毒，也发现分子内重组的效率远高于分子间重组。(Choi et al.，J.Virol.79：6801-6807，2005)。1型单纯疱疹病毒也显示高水平的重组。(Dutch et al.，J.Virol.66：277-285)。在痘病毒中已经发现了高频率的同源重组。使用实验性系统通过在两个1.5kb的DNA直接重复之间放置胸苷激酶(tk)基因测定牛痘病毒中的重组。(Ball，J.Virol.61：1788-1795，1987)。在非选择条件下前八次传代的每一个传代过程中，40％的tk+牛痘病毒丧失了其tk+表型。(同上)。在非选择条件下，tk-病毒的丰度提高至总病毒群的99.73％。(同上)。甚至在选择条件下，重组以如此高的频率发生以致从单个斑分离的大多数传染性病毒颗粒都含有已经发生重组并因此丧失了tk基因的DNA。(同上)。利用经设计以表达三个异源基因(全部由VV p7.5-启动子表达)的重组牛痘病毒，Howley等人，Gene 172：233-237，1996证明了在重复启动子序列之间的重组。经设计包含来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的M蛋白的C-重复区(CRP)的牛痘病毒重组体包含含有1至高于20个CRP拷贝的变体的复杂混合体。(Hruby et al.，P.N.A.S.88：3190-3194，1991)。

虽然已经证明插入至MVA的不同插入位点并具有约60-75％同源性的多个基因都产生稳定的多重组病毒(WO 03/097846)，然而本领域需要以下组合物和方法：其降低载体(例如病毒载体)内的分子内重组水平，从而能够产生包含具有较长的同一性序列段的多个同源核苷酸序列的稳定载体。

发明内容

本发明涉及重组载体及其制备和使用方法。