[发明专利]产生腺病毒载体的方法

说明书

本发明涉及细胞培养和腺病毒生产领域。更具体地，本发明涉及培养哺乳动物细胞、用腺病毒感染这些细胞以及从中产生腺病毒颗粒的改良的方法。

背景技术

近年来在使用重组病毒载体的DNA免疫接种领域中的进展产生了大规模生产临床级材料的需要。需要能支持欠发达和最不发达国家足够量的重组基于腺病毒的疫苗以对抗肺结核和疟疾问题的方法。出生组评估示出在2010-2015年在欠发达和最不发达地区预期有150,000,000以上的出生人口。基于这个出生组，预计每年需要的疫苗可达到大约1.5x10¹⁹病毒颗粒(VP)(http://esa.un.org/unpp/index.asp？panel＝2)。

已经描述了一些生产腺病毒的方法。这些方法使用在滚瓶、细胞工厂(Nunclon from Nunc or CellStack from Corning)或者Cell Cubes(Corning)中的粘附细胞培养。粘附细胞培养的生产过程不能满足基于腺病毒疫苗的世界范围需要。因此，用于粘附方法中的细胞经改造适合悬浮培养(例如HEK293和PER.C6细胞系)。使用悬浮培养可以使生产方法至大规模生物反应器范围。腺病毒生产的悬浮细胞培养通常在3-20L规模实现，有报道已经成功扩大至100L(Kamen et al.，2004)和250L(Xie et al.，2003)。报道了其中预期扩大至10,000L规模的实验(Xie et al.，2003)。

然而，扩大至10,000L规模的主要缺点是高资金总额(CAPEX)，需要设计和建造10,000L的生物反应器设备。此外，在BSL 2条件下建造10,000L设备的CAPEX投入必须在甚至难以预料所述产物是否能成功之前实现(IV期及以外)。10,000L生物反应器设备的总投资费用在225,000,000至320,000,000之间(Estape et al.，2006)。因此，在较小规模如在1000L或者更小的生物反应器中制备是可取的。

使用现有的方法，在1000L规模必须一年生产超过150批次以达到1.5x10¹⁹VP/年的目标。因此，需要改良腺病毒生产系统，改良腺病毒颗粒的产量，以满足腺病毒疫苗在世界范围的需要，优选在非过高成本下满足该需要。

腺病毒生产优化中遇到的一个问题是所谓的“细胞密度效应”。在分批模式操作中，一些参考文献提示在腺病毒生产中存在感染时的最佳细胞密度。最佳密度在0.5-1x10⁶个细胞/mL之间(Maranga et al.，2005；Kamen et al.，2004)。在一批搅拌罐生物反应器中产生腺病毒(Ad5)示出，直至大约0.9x10⁶个细胞/mL时，每个细胞的病毒生产率仍保持恒定，但是在大约1x10⁶个细胞/mL时突然下降(Altaras et al.，2005)。超过2x10⁶个细胞/mL时，无感染性病毒颗粒可检测出。产量随感染的细胞密度而下降，与具体产量相关的断点(breakpoint)是培养基依赖性的。迄今为止还没有可商购的培养基示出具有支持病毒颗粒高产量同时保持在1x10⁶个细胞/mL以上的细胞密度特异性最佳生产的潜力(Kamen et al.，2004)。这种下降的原因还未知，但是可能是由于对于病毒生产的优先的养分有效性，或者由于对于病毒生产是抑制性的高代谢物浓度所致。

补料分批运行如添加葡萄糖、谷氨酰胺和氨基酸使得可以在直至2x10⁶个细胞/mL的细胞密度感染。然而，在高细胞密度实现的生产率低于在1x10⁶个细胞/mL的细胞密度进行感染获得的那些生产率(Kamen et al.，2004)。

在灌注方法中，细胞通过中空纤维、旋转过滤器(spin filter)或者声波分离器(acoustic separators)被保留在生物反应器中，而培养基灌注在生物反应器中。在这些方法中，有时可达到＞100x10⁶个细胞/mL的细胞密度(例如Yallop et al.，2005)。