[发明专利]杆状病毒载体

说明书

本发明涉及用于将基因插入到杆状病毒序列的基因座中的转移载体。本发明还涉及使用转移载体和衍生的杆粒和杆状病毒的方法。

已经将杆状病毒表达系统用于在真核细胞中表达数以千计的蛋白质用于结构和生物化学研究(14)。除了表达单个重组蛋白的能力之外，杆状病毒系统也已用于共同表达形成复合物的多种蛋白(15-22)。这一点是重要的，因为基因组范围内的相互作用的筛选揭示了活细胞的多种关键功能是由多亚基蛋白复合物完成的(23)。已经使用了两种主要的策略利用杆状病毒系统实现蛋白质的共表达。使用各自表达一种重组蛋白的两种或者多种病毒共感染细胞是目前为止最常见的方法(19，24，25)。然而，这些研究中蛋白质复合物的产率通常变化很大并且由两种不同的杆状病毒共感染相同的细胞不满足泊松分布(poisson distribution)(26)。因此，尽管共感染方法在技术上简单，但在实践中其仅限于相对简单的复合物的回收，用于不需要大量纯化蛋白的应用。

对于例如结构研究和需要多种蛋白质的大规模的疫苗试验的应用而言，以及对于由多个亚基形成的更加复杂的复合物而言，使用了共表达来自插入到多角体蛋白或者P10位置的多个类似表达框中的的蛋白质的可选方法(15-18，22，27)。该方法的优点在于在培养物中的每一个被重组病毒感染的细胞都以可再生的方式表达形成蛋白质复合物所需要的蛋白质。将共感染和单独杆状病毒方法进行比较时，单独杆状病毒方法证明具有显著更高的重组复合物产率(28)。然而，使用单独的重组病毒表达多种蛋白质并不是没有缺点。尽管棒状的杆状病毒看起来似乎对于其基因组中的插入相当有耐受力，但基因是通过同源重组转移到病毒，同时转移载体的尺寸必须容易在大肠杆菌中操作。因此，对于能插入到转移载体中的基因的数目有限制。在实践中，这意味着不大可能表达来自单个座位上的多于4种的蛋白质。除此之外，杆状病毒含有表达蛋白质的序列，该蛋白质促进同源重组(29-32)。因此，含有大量重复序列的病毒容易发生重排和重组(21，33，34)。

通过在杆粒的chiA/cathepsin基因座插入loxP位点，修改了单独杆状病毒共表达的方法，所述的杆粒已经在多角体蛋白基因座上含有Tn7的靶点(20)。这使得通过在大肠杆菌中的重组在这些基因座的每一个中插入多个表达框。正如假定这个系统依赖于经过修饰以表达不同基因的表达框的重复复制所预料的那样，有证据显示插入到该系统中在某种程度上在遗传上不稳定(21)。

最近的杆状病毒研究受益于ET重组系统的使用，该重组系统使得能够选择性地敲除病毒的基因(35-49)。然而，还未检验这种技术改造和促进在p10和多角体蛋白之外的基因座上表达蛋白的潜力。

本发明涉及从单个的杆状病毒基因组中有效地表达多种重组蛋白质(即杆状病毒蛋白质)的方法。该方法使得能够使用ET重组系统在病毒基因组内的不同基因座上有效地插入单个的蛋白质表达框。除此之外，该方法使得能表达具有多个亚基的复合物。