[发明专利]显微镜装置以及使用该显微镜装置的荧光观察方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在生物体组织等的荧光观察等中使用的显微镜装置以及使用了该显微镜装置的被观察物的荧光观察方法。

背景技术

在分子生物学领域等中，对生物体组织和细胞内离子、分子等的观察是必须的技术。光学显微镜主要用于观察生物体组织。另外，激光共聚焦显微镜用于用光照射生物体细胞的一部分并使其照射位置移动来观察细胞的一部分。

作为光学显微镜的主要观察技术之一，有如下一种荧光观察法：对生物体组织的细胞内的离子、分子附加荧光色素，对该荧光色素照射激励光，观察被激励的荧光色素所发出的荧光。

荧光和激励光的波长是不同的。因而，能够通过对荧光进行分析来检测细胞内分子、测量浓度。因此，荧光观察具有以下优点。

(i)离子、分子的大小也能够观察。

(ii)能够仅观察特定的离子、分子。

(iii)荧光的亮度与离子、分子浓度相应地发生变化，因此能够测量它们的浓度。

然而，一般来说荧光观察也具有以下缺点。

(i)在激励光的波长处于紫外波段的情况下，激励光对于细胞来说是有毒的。

(ii)当持续射出激励光时荧光色素会褪色。褪色是指荧光的强度变弱。

当使用能够进行荧光观察的荧光显微镜来观察移动的细胞时，细胞有时会跑出显微镜的视野外而使观察中断。

作为这种问题的解决方法，(1)降低物镜的倍率来扩展视野，(2)以机械或化学的方式抑制细胞的移动，(3)移动载物台来使细胞的位置处于视野的中心。但是，(1)的方法使空间分辨率降低，(2)的方法有可能对细胞产生不良影响。

针对上述(3)的解决方法，在专利文献1和专利文献2中公开了一种为了对微小的观察物进行观察而具备对被观察物进行追踪的机构的光学显微镜。这些光学显微镜能够使用透射光来控制细胞位置和观察区域并进行透射光记录。

在专利文献3～5中，公开了一种能够使用荧光来控制细胞位置和观察区域并进行荧光记录的荧光显微镜。

在非专利文献1～5中，报告了一种将移动的草履虫作为比较大的被观察物固定在视野内来进行观察的方法。

作为能够在培养液中自由移动的细胞中的在医学和生物学领域受重视的细胞，可以举出具有能够保护人体免受细菌、病毒伤害的功能的免疫细胞(参照非专利文献6)。

与免疫功能有关的细胞内分子大量存在，而为了检测这些分子、测量分子浓度的时间变化，必须使用荧光观察。

在免疫细胞中，不怎么附着于载玻片表面而进行浮游的细胞被分类为浮游细胞。皿中的浮游细胞的位置是根据培养液的对流、重力、皿的壁部和底部、水面以及细胞之间的相互作用等而始终改变的。为了观察浮游细胞，也考虑了例如使用非专利文献1中报告的奥先生等人的手法来追踪一个细胞的方法。

专利文献1：日本特开平5-80255号公报

专利文献2：日本特开平7-2535487号公报

专利文献3：日本特开平7-261097号公报

专利文献4：日本特开2005-214924号公报

专利文献5：日本特开2006-292420号公报

专利文献6：WO2003/102636号公报

非专利文献1：H.Oku，N.Ogawa，Ishikawa，K.Hashimoto，“Two-dimensional tracking of a motile micro-organism allowing high-resolution observation with various imaging techniques”，Review of Scientific Instruments，Vol.76，No.3，2005

非专利文献2：H.Oku，M.Ishikawa，Theodorus，and K.Hashimoto，“High-speed autofocusing of a cell using diffraction patterns”，Optics Express，Vol.14，No.9，pp.3952-3960，2006

非专利文献3：奥寛雅，石井抱，石川正俊：マイクロビジユアルフイ一ドバツクシステム，電子情報通信学会誌D-II，Vol.J84-D-II，No.6，pp.994-1002，2001

非专利文献4：奥寛雅，石川正俊：キロヘルツオ一ダ一で応答可能な高速ビジヨンチツプ用可変焦点レンズの構造，光学，Vol.31，No.10，pp.758-764，2002