[发明专利]具有生产N‑乙酰葡糖胺能力的棒状杆菌属微生物及用其生产N‑乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因改造的生产N-乙酰葡糖胺的棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，以及用其生产N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的方法。

背景技术

葡糖胺是葡萄糖的氨基衍生物，以及N-乙酰葡糖胺是葡糖胺的乙酰化衍生物。它们是许多天然多糖的重要成分，并且能形成细胞的结构材料，构成细胞壁。

N-乙酰葡糖胺是蛋白合成的重要组分，参与组织再生，因此N-乙酰葡糖胺在预防和治疗多种疾病中具有治疗潜力，诸如胃炎、食物过敏、炎性肠病(IBD)、憩室炎、急性和慢性形式的类风湿性关节炎和骨关节炎，以及由于骨关节组织代谢异常导致的病理状况。葡糖胺也被用作预防和治疗人类骨关节疾病的功能性食物。

葡糖胺通过酸水解几丁质(chitin)而获得，几丁质是由N-乙酰葡糖胺衍生的复杂碳水化合物。可选地，葡糖胺也可以通过酸水解壳聚糖而产生。原料几丁质是N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的共聚物，并且是节肢动物和真菌中常见的天然物质。几丁质可以从节肢动物废料(龙虾、小虾、磷虾、蟹、明虾的外骨骼)获得，并且最近更多从廉价的来源如用于柠檬酸生产的真菌生物质中获得

常见的工业实践是通过如下方法来纯化几丁质：用酸和碱的组合处理几丁质，以除去附带矿物质、蛋白质等的其它杂质，然后长时间通过使用浓盐酸在高温下以低收率在单个步骤中将几丁质解聚并脱乙酰基成葡糖胺。作为游离碱的葡糖胺很不稳定，易降解。因此，产生稳定的盐，如盐酸盐。

节肢动物废料和真菌生物质中葡糖胺的含量低，因此产生大体积的废物。葡糖胺非常昂贵，因为生产过程本身具有相对低的收率，并且是能源和化学集约的(energy and chemically intensive)。此外，常见形式的葡糖胺源于贝类，已知在对贝类敏感的人中有过敏反应的可能性。而且，原材料(例如，几丁质的来源，如蟹壳)的可用性逐渐变得有限。因此，对以高得率生产用于商业销售和使用的葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的具有成本效益的方法存在需求。

PCT公开WO 02/66667公开了从微生物质制备葡糖胺以除去过敏反应可能性的方法。该生产方法克服了与贝类过敏有关的问题，但遇到的主要问题是得率低。更具体地，由于该方法依赖于在其它产物如柠檬酸发酵过程中产生的生物质废物，不足以生产足够量的葡糖胺以满足对该产品日益增长的市场需求。

同时，N-乙酰葡糖胺目前是通过用有机乙酰化试剂如乙酸酐乙酰化葡糖胺而生产的，但这种生产方法需要的成本高。同样，由于生产得率低，不易大规模生产N-乙酰葡糖胺。

为克服这些问题，美国专利7,332,304公开了通过大肠杆菌(E.coli)发酵生产N-乙酰葡糖胺的方法。该方法提出用大肠杆菌发酵以获得高N-乙酰葡糖胺生产得率，这极大地解决了所遇到的问题，包括由于传统工艺复杂导致的低N-乙酰葡糖胺生产得率。另外，已知葡糖胺可以通过简单的酸处理使N-乙酰葡糖胺去乙酰化来生产(Novikov V.Y.et al.Russ.J.Appl.Chem.1997：1467-1470)，因此也有可能以高得率生产葡糖胺。

然而，该方法不适用于生产保健食品，因为大肠杆菌的使用产生了潜在有毒的内毒素。另外，葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶——其对N-乙酰葡糖胺的生产很重要(参见图1：GNA1)——在大肠杆菌中不存在，因此要引入其它微生物，如酵母。有一个限制是关键酶的表达需要可诱导的表达系统(Deng M.D.et al.Met Eng.2005：201-214)。关键酶不受调控的表达引起细胞增殖的严重抑制。可诱导表达系统的劣势在于需要诱导材料，导致生产成本增加，并且应当确定诱导时间点，因此认为其不适于大规模发酵的工业化生产。在生产安全和工业化改进的可能性方面，上述方法具有使用大肠杆菌和可诱导表达系统的缺点。

迄今为止，大肠杆菌发酵技术被开发来克服原材料的可用性有限和生产得率低的问题。然而，还没有适于生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的对人和动物安全的菌株。另外，还没有利用组成性表达系统而非可诱导表达系统以利于工业化酶生产的生产菌株的报道。

为解决上述问题，本发明人开发了用于大规模发酵N-乙酰葡糖胺和葡糖胺而不引起环境问题，能够实现生产稳定性和工业应用的棒状杆菌属微生物，以及用该微生物生产N-乙酰葡糖胺和葡糖胺的方法，从而完成本发明。

发明概述

本发明的目的是提供基因改造的生产N-乙酰葡糖胺的棒状杆菌属微生物，优选具有葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性和降低或缺失的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的棒状杆菌属微生物。