[发明专利]评价细胞状态的方法

说明书

相关申请的相互参照

本申请要求2008年11月21日申请的日本特愿2008-298819号的优先权，将其全部记载内容特别作为公开在本文中引用。

技术领域

本发明涉及评价细胞状态的方法，例如对进行了分化诱导的干细胞或前体细胞的分化水平进行评价的方法，特别是对诱导分化成了心肌细胞或神经细胞的干细胞或前体细胞的分化水平进行评价的方法。

背景技术

随着细胞工程学、再生医疗的发展，需要定量性地且迅速地对细胞的状态进行评价的方法。以往广泛利用由特定的基因、蛋白质的表达水平来评价细胞状态的方法。

以下举出一例。从二十世纪七十年代起，对干细胞(例如作为iPS细胞、ES细胞等已知)、前体细胞的分化诱导进行了研究。直至二十世纪九十年代，主要通过使用特异性抗体的组织染色、流式细胞术来检测表达蛋白质，由此对该细胞的分化水平进行研究。因此，仅得到半定量性的信息。但是，2000年以后，通常使用定量性的RT-PCR法，可以绝对定量性地检测分化时特异性的基因转录(非专利文献1)。但是，进行细胞分化时，存在虽然进行转录未翻译的基因，暗示基因的转录水平并非直接反映分化水平(非专利文献2)。

还存在通过对分化诱导后释放到培养基中的特异性蛋白质进行检测来进行分化水平的绝对定量的方法(专利文献1)。但是，检测特异性的蛋白质时，检测灵敏度有可能变差。而且，不存在适当的分泌蛋白质时，有必要导入报道基因(专利文献2)。

[专利文献1] 日本特开2007-228873(P2007-228873A)

[专利文献2] 日本特开2007-37434(P2007-37434A)

[专利文献3] WO2004/058687

[非专利文献1] Bustin, S.A. J Mol Endocrinol. 25: 69-193 (2000)

[非专利文献2] Wen, J. et al., J Cellular Biochem 102: 149-160 (2007)

[非专利文献3] 现代化学、东京化学同人、435、55-61(2007)

[非专利文献4] M. Yamaguchi et al., ABSTRACTS 24^th International Carbohydrate Symposium. Oslo, Norway 27. July-1. August, 2008. C-P040

上述专利文献1、2和3以及非专利文献1～4的全部记载内容特别作为公开在本文中引用。

发明内容

如上所述，细胞的状态，例如伴随着细胞分化的基因转录变化的跟踪通常定量性优异，但是未必反映细胞的状态(非专利文献2)。

另一方面，作为翻译产物的蛋白质的检测，在检测分化等细胞的状态的方面，可以成为准确的评价基准。但是没有适当的特异抗体或其检测灵敏度不优异时，难以进行定量性的分析，结果广泛使用性降低。

因此，本发明欲解决的课题在于，发现替代基因、蛋白质的细胞状态、例如分化水平的新指标，进而发现可以尽可能定量性地掌握该新指标的方法，且提供使用该新指标，掌握分化成了特定细胞的细胞的分化水平的方法。

本发明中，着眼于根据细胞状态的变化，例如分化状态的变化，而其糖链表达谱(プロファイル)可以定量性地变化(非专利文献4)。

以往的糖链结构的分类方法是基于其生物合成路径而分为高甘露糖型、杂合型、复合型三种。但是本发明人发现，如图5所示，若划分杂合型和复合型，则不能判定细胞的分化。比率表示百分率(%)、全部(total)表示表达量(pmol)。通过质量分析来确定糖链结构的方法中，是杂合型还是复合型，存在仅通过一次分析不能确定的结构。对于这种结构，在图5的图中表示为N/I。

因此，本发明中，基于由西村等人开发的高速全面的(網羅的)糖链富集技术(glycoblotting(糖印迹)法)(专利文献3、非专利文献3)，由细胞的状态变化，例如由分化前后的细胞全面地捕捉糖链，通过MALDI-TOF/MS等质量分析技术弄清存在于各细胞中的糖链的定量性的表达谱。基于此，联系细胞的分化水平(细胞的分化阶段或类型)，发现变动的糖链。即，鉴定成为分化标志的糖链或变动的糖链，确立灵敏度、特异性都高，定量性地判定分化水平的方法。进而发现，基于其中得到的信息，导入糖链类型的概念，由此可以将细胞亚类化，基于此，完成可以定量性地判定细胞分化的程度的本发明(图6)。