[发明专利]使用双链核酸特异性染料在固体表面上的实时多重PCR检测

权利要求书

1. 监控一种或多种靶核酸的扩增的方法，其包括以下步骤：

a. 提供具有大量核酸捕获探针被固定化在其表面上的基片，其中各个所述核酸捕获探针互补于靶核酸，不同的同一性的核酸捕获探针在空间上彼此分离；

b. 向所述基片中加入一种或多种靶核酸的样品和聚合酶链式反应中核酸扩增所需的另外的试剂，所述另外的试剂包含正向和反向引物以及至少一种能够与双链核酸特异性地相互作用的染料；

c. 通过包括热循环的过程扩增所述一种或多种靶核酸，所述过程包括以下步骤：

       i. 使所述一种或多种靶核酸变性；

       ii. 使所述正向和反向引物与所述一种或多种靶核酸的变性链的各自链退火；

       iii. 延伸所述退火的正向和反向引物；

d. 将步骤c.i中变性的一种或多种靶核酸与所述核酸捕获探针杂交，任选地伴随延伸步骤c.ii；

e. 通过测定从至少一种能够与双链核酸特异性地相互作用的染料中产生的信号来检测所述一种或多种靶核酸与所述捕获探针的杂交。

2. 根据权利要求1的方法，其包括以下步骤：

a. 提供具有大量核酸捕获探针被固定化在其表面上的基片，其中各个所述核酸捕获探针互补于靶核酸，不同的同一性的核酸捕获探针在空间上彼此分离；

b. 向所述基片中加入一种或多种靶核酸的样品和聚合酶链式反应中核酸扩增所需的另外的试剂，所述另外的试剂包含正向和反向引物以及至少一种能够与双链核酸特异性地相互作用的染料；

c. 通过包括热循环的过程扩增所述一种或多种靶核酸，所述过程包括以下步骤：

       i. 使所述一种或多种靶核酸变性；

       ii. 使所述正向和反向引物与所述一种或多种靶核酸的变性链的各自链退火；

       iii. 延伸所述退火的正向和反向引物；

d. 测定样品中扩增的靶核酸的浓度；

e. 将步骤c.i中变性的一种或多种靶核酸与所述核酸捕获探针杂交，任选地伴随延伸步骤c.ii；

f. 通过测定从至少一种能够与双链核酸特异性地相互作用的染料中产生的信号来检测步骤d中所述一种或多种扩增的靶核酸与所述捕获探针的杂交。

3. 根据权利要求2的方法，其包括以下步骤：

a. 提供具有大量核酸捕获探针被固定化在其表面上的基片，其中各个所述核酸捕获探针互补于靶核酸，不同的同一性的核酸捕获探针在空间上彼此分离；

b. 向所述基片中加入一种或多种靶核酸的样品和聚合酶链式反应中核酸扩增所需的另外的试剂，所述另外的试剂包含正向和反向引物以及至少一种能够与双链核酸特异性地相互作用的染料；

c. 向所述样品中加入已知同一性的双链核酸和聚合酶链式反应中核酸扩增所需的另外的试剂，所述另外的试剂包含正向和反向引物以及对照探针，所述对照探针允许在不同于能够与双链核酸特异性地相互作用的染料的波长处进行荧光检测，其中所述引物和对照探针对所述已知同一性的双链核酸是特异性的；

d. 通过包括热循环的过程扩增所述一种或多种靶核酸及所述已知同一性的双链核酸，所述过程包括以下步骤：

       i. 使所述一种或多种靶核酸变性；

       ii. 使所述正向和反向引物与所述一种或多种靶核酸的变性链的各自链退火；

       iii. 延伸所述退火的正向和反向引物；

e. 测定样品中扩增的靶核酸的浓度；

f. 将步骤d.i中变性的一种或多种靶核酸与所述核酸捕获探针杂交，任选地伴随延伸步骤d.ii；

g. 通过测定从至少一种能够与双链核酸特异性地相互作用的染料中产生的信号来检测步骤d中所述一种或多种扩增的靶核酸与所述捕获探针的杂交。

4. 根据权利要求2或3的方法，其中测定样品中扩增的靶核酸序列的浓度包括记录校准曲线，所述校准曲线从利用确定浓度的已知靶核酸序列进行权利要求2或3的方法中得到。

5. 根据权利要求2到4中任意一项的方法，其中如果测定样品中扩增的靶核酸序列的浓度显示扩增的靶核酸的浓度已增加到高于检测杂交的检测限，则进行检测杂交。

6. 根据权利要求5的方法，其中如果测定样品中扩增的靶核酸序列的浓度显示扩增的靶核酸的浓度已增加到高于至少50 pM，则进行检测杂交。