[发明专利]O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶及其突变体的新型底物

说明书

背景技术

亲电化合物如N-甲基-N-亚硝基脲的致突变效应和致癌效应主要原因为DNA的鸟嘌呤残基发生O⁶-烷基化。哺乳动物和细菌中存在防止这一DNA烷基化的保护机制，特别是O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)能修复这些损伤(lesions)。AGT将位于烷基化鸟嘌呤O⁶位上的烷基基团转移至AGT自身的其中一个半胱氨酸的巯基上，导致AGT发生不可逆的烷基化。这一基团转移通过双分子亲核取代(nucleophilic substitution of type 2)进行，这就解释了为什么除烷基可能发生转移外，苄基也可能发生转移。

由于肿瘤细胞中AGT的过表达是对基于DNA烷基化发挥作用的药物(如丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)和双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲)产生抗性的主要原因，因此提出将AGT抑制剂用作化疗治疗中的敏化剂(sensitizing agent)(Pegg等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51：167-223，1995)。美国专利5 691 307中记载了苄基上带有各种取代基的O⁶-苄基鸟嘌呤衍生物，还记载了它们用于降低肿瘤细胞中AGT水平、从而增强它们对基于使用烷基化试剂治疗的敏感性的用途。类似地，专利申请WO 97/20843公开了用于此用途的其他化合物，所述化合物为O⁶-苄基甲基嘧啶衍生物和O⁶-杂芳基甲基嘧啶衍生物的形式。

专利DE 199 03 895公开了对AGT进行的分析，该分析基于AGT和O⁶-烷基鸟嘌呤的生物素化衍生物之间的反应而进行，该反应造成AGT的生物素化，这样使得能够在覆盖有链霉亲和素的板上分离AGT，并通过例如ELISA分析对AGT进行检测。提出用这种技术是为了监测癌组织中的AGT水平，也是为了突出(highlight)AGT抑制剂。

WO 01/85221提出使用O⁶-苄基鸟嘌呤的氟代或碘代放射性衍生物来检测AGT。

同样出于测定该酶在癌细胞中的表达水平以改善化疗治疗效果的目的，Damoiseaux等，ChemBiochem.4：285-287，2001公开了引入到寡脱氧核糖核苷酸中的O⁶-烷基鸟嘌呤衍生物，以及该衍生物作为标记AGT的探针的用途。

申请WO 02/083937记载了用于对与AGT融合的目标蛋白进行检测和调控(manipulate)的方法，该方法在于：将这种融合蛋白与带有标记的AGT底物接触，这样使得在将目标分子转移到AGT后能够检测或调控这种目标蛋白。该申请还公开了包含AGT的各种融合蛋白、有关AGT底物结构的一般原则以及各种标记和检测所述标记的方法。

申请WO 2004/031404记载了包含AGT和目标蛋白的特定融合蛋白，该融合蛋白能够用于前述方法中；还记载了通过此方法得到的标记后的融合蛋白以及使用所述融合蛋白的方法。

申请WO 2004/031405和WO 2005/085470记载了带有一个或多个标记的特定AGT底物，并且还记载了它们的制造方法，这些底物能够用于WO 02/083937中记载的方法。

AGT底物的实例是如下的苄基鸟嘌呤衍生物和苄基胞嘧啶衍生物：

发明内容

本发明涉及AGT酶或其突变体的新型底物，该底物由苄基核苷酸通过接头(linker)与目标分子共价键合而构成，所述接头包含具有5个或6个原子的环。这些底物特别适于实施如专利申请WO 02/083937中记载的、对与AGT融合的目标蛋白进行检测和调控的技术。目前，Covalys采用已知商品名为“SNAP-tag”和“CLIP-tag”的酶开发了这项技术。