[发明专利]在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法

权利要求书

1.一种用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括：

(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：

(i)第一多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；

(ii)第二多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；

(iii)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和

(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’；

其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失所述基因或其部分并用核酸构建体替代所述基因或其部分；

(b)通过施以阳性选择来选择并分离具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和

(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而缺失第一和第二多核苷酸。

2.权利要求1的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。

3.权利要求1的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。

4.权利要求1-3任一项的方法，还包括(d)将编码目标多肽的多核苷酸引入步骤(c)的分离的细胞。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。

6.权利要求1的方法，其中整个基因完全缺失，不留下外源DNA。