[发明专利]测定钠-质子-交换蛋白配体功效的方法

说明书

本发明涉及测定离子通道配体的功效的方法。

膜转运蛋白的Na⁺/H⁺-交换蛋白或者钠-质子-交换蛋白(NHE)家族利用细胞外到细胞内Na⁺梯度来驱使H⁺从细胞中流出。这组转运蛋白(或者离子通道)实现的基本功能包括调节细胞体积和pH以及在细胞增殖中的许可作用和Na⁺的经上皮转运。哺乳动物NHE是一种发挥将1个细胞内质子交换1个细胞外钠离子作用的膜内在蛋白质。通过涉及离子流动，NHE可用于调节细胞内pH和细胞体积，以及启动细胞生长或者机能状态的变化。除了其生理学作用之外，NHE还在人病理学中起重要作用。在心肌梗塞期间和之后导致的人心肌膜损伤中，NHE引起的转运起着关键作用，并且被认为代表在癌性细胞的致癌性转化中的重要步骤。因此，NHE多年来已经是心血管和肿瘤学研究中的靶标，并且已经对成千上万种化合物进行NHE抑制性和选择性的筛选。

测定NHE拮抗剂的效能的标准方法是Schwark和其合作者(Schwark et al.，1998，Pflügers Arch.，336(5)：797-800)以及Wiemann和其合作者(Wiemann etal.，1999，PflügersArch.，436(3)：255-262)描述的体外测定。在测定配体在所选的NHE上的IC₅₀之后，可用相同的测定测量对其它NHE的选择性。一般而言，选择具有优良选择性的有效力配体用于进一步的药代动力学研究、配体的体内验证研究。然而，一些非常有效力的化合物在体内研究中仅仅显示微小的效果。其原因可能是高的蛋白质结合、低的生物利用度或者其它降低化合物在血浆中的有效浓度的作用。期望在药物开发过程的非常早的时期排除这些化合物以节省时间和资源。

由于几种化合物的体外IC₅₀与药理学效能(功效)之间的偏差，因而需要发展测定或者模拟NHE配体或者其它离子通道配体在体内的功效的方法。

因此，本发明的第一个主题是提供测定离子通道配体功效的方法。优选地，该测试应该是节约时间和成本的。在本申请的上下文中，术语离子通道理解为包括被动的离子通道以及主动的离子通道(离子转运蛋白)。

出乎意料地发现，离子通道配体的功效(尤其是NHE拮抗剂的功效)可通过使表达离子通道的细胞与动物血浆和离子通道配体接触来测定。在该测试中，可测定离子通道配体对细胞的作用，其中该作用反映配体的体内功效。

因此，本发明的第一方面提供测定离子通道配体的功效的方法，其包括下面步骤：

a)使表达离子通道的细胞与下面物质接触

iii)动物血浆，和

iv)离子通道配体；

以及

b)测定离子通道配体对细胞的作用。

简而言之，该方法可如下进行：将表达审议中的表达离子通道的适当细胞保持(例如培养)在适当的条件下，并与动物血浆和所述离子通道配体进行接触(温育)。这两成分可同时或者一起添加。在足以顾及对细胞的作用的时间之后，测定对细胞的作用。在所述接触之后或者同时，观察作用(信号)，其中对作用的检测指示了离子通道配体对细胞的作用。

在本发明的上下文中，术语“离子通道配体的功效”涉及离子通道配体的药理学效能。与无血浆条件下的体外测定形成对比，在血浆的存在下进行的本发明方法虑及蛋白质结合量，吸收的程度和速率，配体利用度的分布、代谢和排泄和/或其它降低化合物在血浆中的有效浓度的作用。当将配体给药于动物并从动物取出血浆时，该方法也虑及吸收的程度和速率，配体的分布、代谢和排泄。这些作用可取决于下列因素，包括但不限于药物的物理性质(疏水性、pKa、溶解性)、药物组成、在进食或者禁食状态下给药、生理节奏特性和/或与其它药物、食物或者内源物质(例如酶)的相互作用。因此，术语“离子通道配体的功效”不但涉及配体与离子通道的结合和下游信号传导的诱导，而且还虑及配体在血浆和/或活的动物中的上述作用。这允许更方便地确认适于例如体内治疗的候选药物和/或排除具有低体内功效的化合物。