[发明专利]与修饰的聚糖相关的方法

说明书

本申请要求于2008年12月19日提交的美国临时专利申请序列号61/139,224的优先权，其全部披露通过引用结合在此。

背景

对于结合糖(例如糖蛋白)上的聚糖的修饰通常显著地影响该结合糖的功能。例如，聚糖修饰可以影响糖蛋白正确折叠的能力、稳定性(例如，对蛋白质分解和/或其他降解的耐受性)、催化活性、药效学和/或药物代谢动力学特性、和/或与其他分子的相互作用。糖蛋白的聚糖修饰可以影响该糖蛋白的转运和靶向。例如，糖蛋白的聚糖修饰可以影响该糖蛋白是否保留在细胞内(包括，例如将该糖蛋白正确地靶向到正确的一个或多个亚细胞区室中)，该糖蛋白是否将是膜结合的和/或该糖蛋白是否将是从细胞中分泌的。

概述

聚糖通常通过唾液酸化(即，通过加入一种唾液酸)来修饰。当分析糖蛋白时通常忽略了对聚糖的非常规修饰，例如硫酸化、磷酸化以及多乙酰化唾液酸化(例如，二乙酰化唾液酸化)。这类修饰可能被忽略至少部分是由于它们的分析的复杂性以及这类修饰的不稳定性。本披露包括以下认识，即虽然如此，非常规修饰是生物学相关的并且用于对它们进行鉴别和定量的方法是令人希望的。

除其他事项之外，本披露提供了用于对非常规修饰的聚糖进行富集、鉴别、检测和/或定量的方法。在很多实施方案中，这些方法包括提供一种聚糖制品(例如唾液酸酶处理过的聚糖制品)，从该聚糖制品中已经释放了唾液酸类。这种制品包括聚糖(即，耐唾液酸酶的聚糖)，这些聚糖没有被释放唾液酸的处理所切割。所提供的方法典型地包括使所提供的聚糖制品经受一种分离技术，该技术将具有一个第一电荷的聚糖类与不带电的聚糖类和/或具有一个第二电荷的聚糖类分开，和/或基于聚糖的荷质比来分离它们；并且任选地对分离出的聚糖进行定量。在很多实施方案中，定量包括使用至少一种定量标准物。

附图简要描述

[0001]图1描绘了一个示例性的N-连接的聚糖的结构。

图2描绘了聚糖中修饰的残基的非限制性实例：甘露糖-6-磷酸(M6P)和6-磺酸基-N-乙酰葡糖胺(6-磺酸基-GlcNAc)。为了清楚起见，在没有另外的修饰下描绘了一种常见唾液酸的结构(N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac))。正常地乙酰化出现在位置5处(已示出)；在位置7、8、和9处可以发生另外的乙酰化。如在此所使用的，关于唾液酸“多乙酰化”是指在位置7、8、和9中两个或更多个位置处另外的乙酰化。关于唾液酸使用“二乙酰化”来指在位置7、8、和9中两个位置处另外的乙酰化。

图3描绘了在唾液酸酶处理后，从一个中国研究来源获得的，从具有生物活性的促红细胞生成素治疗性糖蛋白衍生的非常规修饰的种类的一种阴离子交换层析-高效液相色谱(AEX-HPLC)图。插图描绘了使用2-氨基苯甲酰胺-壳二糖作为外标物的一个校准曲线。在此被鉴别为非常规修饰的种类的这些峰被进一步鉴别为磷酸化的N-聚糖和硫酸化的聚糖。

图4描绘了在唾液酸酶处理后，从具有与图3中所描述的促红细胞生成素治疗性糖蛋白97％的氨基酸序列一致性，具有生物活性的感兴趣的一种第二糖蛋白衍生的非常规修饰的种类的一种阴离子交换层析-高效液相色谱(AEX-HPLC)图，。在此被鉴别为非常规修饰的种类的这些峰被进一步鉴别为磷酸化的N-聚糖和硫酸化的聚糖。

图5描绘了来自硫酸化的聚糖的色谱分析的结果，这些聚糖是从小鼠体内产生的单克隆抗EGFR抗体衍生的。通过质谱法来鉴别该峰内聚糖的构成。例如在图B中所使用的命名法中，“5，4，1，0，0+SO3”相应于HexNAc5、Hex4、Fuc1、NeuAc0、NeuGc0+一个硫酸盐。

图6描绘了来自硫酸化的和二乙酰化唾液酸化的聚糖的色谱分析的结果，这些聚糖是从来自一个单克隆(克隆1)的CTLA4-IgG衍生的。通过质谱法来鉴别该峰内聚糖的构成。

图7描绘了来自硫酸化的和二乙酰化唾液酸化的聚糖的色谱分析的结果，这些聚糖是从来自两个不同的单克隆(克隆2，上图；克隆3，下图)的CTLA4-IgG衍生的。

定义

乙酰基：如在此所使用的，术语“乙酰基”(也称作“乙酰基团”并且通常缩写为“Ac”)被用于此处是指具有化学式-COCH₃的官能团。

乙酰化：如在此所使用的，术语“乙酰化”是指通过共价地加入一个乙酰基团来进行修饰。例如，一种乙酰化的聚糖是通过共价地加入一个或多个乙酰基团来进行修饰的一种聚糖。乙酰化的聚糖可以或不可以具有另外的修饰。