[发明专利]大突变分析(BMA)

说明书

技术领域

从突变表型中克隆基因已成为遗传学和生物技术中的长期艰巨任务。特别是在(作物)植物领域中，快速而经济的正向基因克隆方法是急需的。实际上目前正探寻提高正向基因分离速度降低其成本，特别是扩展可以进行基因克隆的物种范围的方法。

背景技术

正向基因克隆的目的是鉴别仅从表型获知，而没有分子信息或序列信息的那些基因。正向遗传学的起点可以是天然存在的表型变体或人工诱导的突变体。

本质上，已经认识了两组正向基因克隆的方法：绘图策略和标签策略。它们是互补的，各自都存在固有局限。

在绘图策略中，通过标记辅助减数分裂重组绘图将表型准确定点在染色体的最小片段上。基于绘图的克隆是非常繁杂的程序，特别可用在小组的模型物种上。

理论上，基于绘图的克隆对于通过有性繁殖而复制的任何生物体都是普遍适用程序(Peters等人(2003)Trends in Plant Science Vol.8No.10pp 484-491)。然而在实践中，存在基本的生物学限制。最重要的是，这关键取决于在感兴趣基因区域内减数分裂重组的良好频率。其次，这在表征很少的大基因组例如在植物如莴苣，胡椒，洋葱，和许多其他基因组中变得越来越困难，因为在其中重复DNA阻碍了DNA标记的非模糊绘图。

在标签策略中，表征成熟的生物突变体(转座子或T-DNA插入片段)被用作有效突变体并作为克隆标签基因的工具。将可转座元件插入基因中会导致功能的丧失或获得，表达模式的变化，或对基因功能没有任何影响，这取决于插入片段是否位于基因的编码或非编码区。负责任何新产生的表型的基因是通过沿着基因组DNA的侧翼片段克隆插入序列而找回的。

在理论上，通过这种可转座元件帮助加标签是克隆基因的优选方法，因为这很快速，并独立于减数分裂重组，而且不要求事先的基因组资源例如基因绘图或大量的序列信息(参见Maes等人Trends Plant Sci.1999三月；4(3)：90-96.)。

该标签方法在少数模型生物体中已经成功，在这些生物体中天然基因标签(转座子)体系是已知的，或大量个体可被随机整合DNA(T-DNA)而转化(参见例如Settles等人，BMC Genomics 2007，8：116，using maize)。除了这小组的物种之外，标签不能或很难应用，原因是由于缺乏已知的插入元件，或者由于种群大小的逻辑限制。逻辑上，为了寻找出一个或几个特异突变体，标签要求几千个个体的种群，因为每个基因组中插入序列数量很低(1-200)。

发明内容

本发明的一个目标在于提供一种新方法，及其用途，其可以实现有效鉴别参与特定表型显现的核酸。该方法可以应用于任何可人工杂交和操作的(植物)物种，而无需该物种的大量序列知识。本发明的其他目标明显地体现在本发明的说明书，实施方式和权利要求中。

定义

在以下说明和实施例中使用几个术语。为了在说明书和权利要求中提供明确且一致的理解，包括这些术语给出的范围，提供以下定义。除非本文另有定义，所有使用的技术和科学术语具有发明所属领域普通技术人员所理解的普通含义。所有公开文献，专利申请，专利和其他参考文献的整体内容都通过引用的方式并入本文。

等位基因：位于同源染色体相同位置上并负责可替换性状的至少两个可替换形式基因的其中一个。非限制性示例是花朵中的花簇颜色基因—单个基因可控制花瓣的颜色，但是可能存在几个不同版本或基因的等位基因。一个版本可形成红色花瓣，而另一可形成白色花瓣。个体花朵的最终颜色取决于其拥有基因的哪两个等位基因及其这两者如何作用。

特征：与生物体的表型质量相关。特征可使自身显现成不同性状。例如，植物可以是以花朵颜色作为特征的植物，红色或白色花朵是该特征的性状A和B。在本发明内，特征(或性状)可以是任意的，只要具有特征第一性状的生物体成员可以在表型上区别于具有特征第二性状的生物体成员。这不仅局限于那些可通过观测生物体直接观察到的区别，也包括那些通过进一步分析生物体而呈现出的特征/形状，例如基于对特定环境的抗性的分析，或基于对这些生物体中特定代谢产物的存在的分析。

“基因表达”或“表达核酸”：与适当的调控区特别是启动子操作连接的DNA区被转录成具有生物活性的RNA的过程，即，该RNA能够被翻译成生物活性蛋白或肽或其自身就有活性。