[发明专利]制备小粒径脂质体的方法

说明书

本申请主张在35USC119(c)以及巴黎公约条件下美国临时申请61/138,353的权益，所述临时申请于2008年12月17日申请，并全文引入本申请作为参考。

发明领域

本发明主要涉及脂质体疫苗生产领域。

发明概述

本发明旨在提供粒径小于约200nm的脂质体。

令人惊奇地发现，在制备脂质体的方法中，若其包含将有机液体(其中溶有脂质)与水混合的步骤，那么有机溶剂的浓度和所产生的混合物的迅速冷却对形成并保持一致的脂质体粒径至关重要。本申请的方法与装置有助于商业化大规模生产包封了药物的匀质脂质体疫苗制剂，即在新颖的条件下，将脂质溶液，其含有溶入与水互溶的有机溶剂中的脂质，混入流动的水中，以促进疫苗质量级别的脂质体不断生成。所述方法使用一种连续混合系统，其中流速比，即脂质溶液流速与水流速之比，保持恒定，由此保持系统中恒定的有机溶剂百分比。所述方法更进一步用一种快速且规模依赖性的冷却步骤，其在脂质体形成后使用并防止脂质体平均粒径的增长。所述方法还进一步提供一种管道排布方法，其促进形成具有理想粒径的脂质体。

为制备粒径小于约200nm的脂质体，依照本申请的方法，有机溶剂/水混合物中的有机溶剂浓度保持在5％到30％之间，更优选地，在10％到25％之间，最优选地，在10％到25％之间；流速比(水/有机溶剂)保持在19∶1到3又1/3∶1之间，更优选地在9∶1到5∶1之间，或在9∶1到4∶1之间；且脂质体混合物的冷却(从约55℃至约30℃)时间少于5小时，更优选地少于2小时，最优选地少于30分钟，更优选基本上即时冷却。

本发明解决了领域内的难题，即批次间的差异性、在冷却中出现的脂质体粒径不期望的增长以及需要诸如超声或增压系统等精密方法。依照本发明制得的脂质体适用于制造人用或兽用疫苗。

附图概述

图1为装置布局示意图，其中的嵌入物描述的是“T”型连接排布，和任选地，是否管道可包括内部突起或挡板以增强湍流度，其有助于混合。

图2为流程图，描述了总体临床制备过程中的各类参数。

图3为一幅照片，显示在使用不同管道直径的情况下染料(模拟脂质/溶剂)和水的聚集情况：(A)两管均为9mm直径；(B)5mm(水)管和3mm(脂质/溶剂)管。

图4为透射电镜照片(放大倍数18K)，显示依照本方法采用20％叔丁醇制备的载有MUC-1肽的脂质体形成。

优选实施方式的详述

本方法可适用于大规模商业化的生产纳米级别的脂质体制剂，特别是那些包括基本上匀质的不超过200nm直径的脂质体粒径。优选地，脂质体中多于90％(采用动态光散射测得的权重(weighted)体积)小于200nm，最优选的，多于99％的小于200nm。此类粒径的颗粒可直接依照工业认可的临床生产标准过滤除菌。

所述粒径均匀的脂质体可依照本发明制备，包括控制有机溶剂的浓度，并在脂质体形成以及接下去的过程中保持其基本恒定。通过控制溶剂浓度有可能控制脂质体颗粒的粒径，所述颗粒是在脂质溶液与水(或其它适于脂质体形成的水性溶剂)汇合和相混时形成的。

在本方法中，脂质溶液与水在管道连接处正下方的“中流”处发生汇合，通过所述管道安排溶液和水被初始泵入。脂质溶液持续地流过一个管道并流入持续流动的水流中。两条液流可能以任何角度交汇，故水和脂质溶液分别流经的管道可能以约90度或小于90度的角度汇合。脂质溶液与水的浑浊混合物，即“溶剂云”，在管道连接处下方形成，且这里也是开始形成脂质体的分界线。

进一步地，脂质/溶剂与水性液体混合成湍流的程度也会有助于脂质体形成。因此，本发明可能包括的装置和连接的一种特征，但并非形成脂质体必需的，是在任何管道的管腔内部存在折流挡板、内向突起或刻纹，它们有助于增加湍流从而促进脂质体的产生。因此，依据本发明，在液体汇聚处制造高剪切的环境有益于制备脂质体。

能在从脂质体形成到将混合物装入储存容器的时间内对混合物进行冷却的在线冷却设备可实现脂质体混合物的快速冷却。这可以通过诸如冷却套管、冷却盘管或将脂质体混合物流经的管道或其他接头处浸没的冰浴来实现。快速冷却可保持脂质体粒径，而慢速冷却时，在有机溶剂的理想浓度下脂质体粒径会随时间增大。

经由控制(1)水流对有机溶剂流的流速比和(2)混合物中有机溶剂的浓度和(3)脂质体形成后立即快速冷却混合物，以及可选地(4)使用湍流增强结构，不断生产出粒径一直维持在一定范围内的脂质体是可能的。