[发明专利]岩藻糖化化合物的合成

说明书

技术领域

本发明涉及生产岩藻糖化化合物以及与之相关的细胞的方法。

背景技术

人乳由碳水化合物，蛋白，脂类，激素，和微量营养物的复合混合物组成，能提供婴儿发育所需的全部养分。此外，人乳还包含若干保护剂。除了免疫球蛋白之外，人乳包含一系列具有保护特性的复合的低聚糖。除了主要的碳水化合物成分乳糖之外，人乳低聚糖(HMO)成分还包括超过130种不同的复合低聚糖。复合低聚糖的这种结构多样性及其大量存在，对人类来说是独一无二的。相反，在牛乳中仅存在微量的、种类更少的复合低聚糖，因此，常用的婴儿乳粉缺少所述低聚糖。

临床资料表明，母乳喂养的婴儿腹泻、呼吸道疾病和中耳炎的发病率都低于乳粉喂养的婴儿。长期以来，人乳的这种保护性作用都一直归因于分泌性免疫球蛋白的存在，不过，业已认识到HMOs可能是母乳喂养婴儿防御病原体的主要物质。

很多复合HMOs表现出与细胞表面糖缀合物，如Lewisx(Le^x)组织-血型抗原Gal(β1-4)[Fuc-(α1-3)]GlcNAc(β1)(Newburg，2001)具有同源性，它通常起着病原体受体的作用。因此，通过分泌可溶性诱饵，模拟细胞表面糖缀合物结构，自然形成了预防感染的有效机制。例如，也已证实HMOs可显著降低致病性大肠杆菌(Escherichia coli)(Cravioto et al.，1991)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(Coppa et al.，2006)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Andersson et al.，1986)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(Ruiz-Palacios et al.，2003)的毒力，并且还能够中和毒素，如大肠杆菌(E.coli)的热稳定性肠毒素(Crane et al.，1994)。除了上面提到过的在肠道中的局部作用之外，HMOs还能够通过进入系统循环在婴儿体内诱发系统性作用(Gnoth et al.，2001)。

HMOs对蛋白-碳水化合物相互作用的影响，例如，对选择素-白细胞结合的影响，可以调节抗原免疫反应，并且减轻炎症反应(Bode，2006，Kunz & Rudloff，2006)。

复合低聚糖是人乳中紧随乳糖和脂肪之后的第三大成分。它们在其还原末端几乎都共同具有乳糖，而在非还原端具有岩藻糖和/或唾液酸。它们由3-32个单糖组成，并且大多包含岩藻糖，具有1-15个岩藻糖单元。因此，岩藻糖化的低聚糖表现出作为生物活性食品成分的巨大潜力，其具有抗感染和预防感染属性。

能催化岩藻糖残基从供体鸟苷二磷酸活化的L-岩藻糖(GDP-L-岩藻糖)向若干受体分子转移的岩藻糖基转移酶(FucTs)，是在动物，植物，真菌和细菌中表达的(Ma et al.，2006)。它们是按照岩藻糖的加成位点进行分类的，因而区分为α1，2，α1，3/4，和α1，6FucTs。除了最初负责HMOs和血型抗原的生物合成的人FucTs之外，业已公开了若干种细菌FucTs。业已充分证明了人类胃病原体幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的FucT活性，它用含有岩藻糖的Lewis抗原修饰其脂多糖(LPS)(Wang et al.，2000)。尚不清楚Lewis抗原结构在H.pylori感染期间的确切作用，不过，已讨论过有关规避宿主免疫系统、附着和集落化的分子模拟(Bergman et al.，2006)。

由于HMOs作为健康促进食品添加剂的巨大潜力，人们对它的节省成本的大规模生产存在极大兴趣。与耗费劳力并且需要多个保护和脱保护步骤的从人乳中提取HMOs和化学合成相比，通过细菌发酵工艺进行生物催化生产是十分有利的(Kretzschmar & Stahl，1998)。最近十年，业已公开了通过重组E.coli或in vitro酶促转化合成HMO的若干研究(Albermann et al.，2001，Dumon et al.，2006，Dumon et al.，2001，Dumon et al.，2004，Koizumi et al.，2000)。不过，生产岩藻糖化的低聚糖的瓶颈是供体核苷糖GDP-岩藻糖的获取问题。这种高能量分子目前无法通过化学或酶促合成以有效方式或节省成本的方式获得。报道岩藻糖化化合物生产系统的大部分出版物认为其取决于E.coli的内源GDP-岩藻糖库，不过，这种糖库是极有限的，并且仅仅被用于诱导合成含岩藻糖的外多糖colanic酸(Grant et al.，1970)。