[发明专利]基于III型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途有效
申请号: | 200980153649.4 | 申请日: | 2009-10-27 |
公开(公告)号: | CN102307896B | 公开(公告)日: | 2016-10-12 |
发明(设计)人: | S·雅各布斯;K·奥奈尔 | 申请(专利权)人: | 森托科尔奥索生物科技公司 |
主分类号: | C07K14/78 | 分类号: | C07K14/78;C40B50/06;C40B40/10;C40B30/04;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N5/10;A61K38/39;A61K45/00;A61K47/48;A61K49/00 |
代理公司: | 中国专利代理(香港)有限公司 72001 | 代理人: | 李进;林毅斌 |
地址: | 美国宾夕*** | 国省代码: | 美国;US |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 iii 型纤连 蛋白 结构 支架 组合 方法 用途 | ||
技术领域
本发明涉及具有新性质的蛋白质支架,所述新性质包括结合细胞靶标的能力。更具体而言,本发明涉及基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列的共有序列的蛋白质支架。
背景技术
当需要对靶分子具有高亲和性和特异性时,单克隆抗体是最广泛使用的治疗性蛋白质类型。但是,可被工程改造成能结合这种靶标的非抗体蛋白质在生物医药行业中也具有很大的重要性。这些“另类的支架”蛋白质可具有优于传统抗体的优点,因为它们尺寸小、缺乏二硫键、稳定性高和能够在原核生物宿主中表达。容易应用新的纯化方法;它们容易缀合到药物/毒素,能有效地渗透到组织中且容易编组成多特异性结合物(binder)(Skerra 2000,Binz和Pluckthun 2005)。
一种这样的另类支架是免疫球蛋白(Ig)折叠。这个折叠存在于抗体以及数千种非抗体蛋白质的可变区。已证实,一种这样的Ig蛋白,即人纤连蛋白的第10个III型纤连蛋白(FN3)重复序列,能容忍表面所暴露的环中的许多突变而保持总体的Ig折叠结构。因此,已建立了这些环的氨基酸变体的文库,并选择出了针对许多不同的靶标的特异性结合物。(Koide等人,1998,Karatan等人,2004)。已发现这种经工程改造的FN3结构域能以高亲和力结合靶标,同时保持重要的生物物理性质(Parker等人,2005)。
潜在的另选支架分子的合乎需要的物理性质包括热稳定性高以及热折叠和解折叠之间可逆。已应用了几种方法来提高蛋白质和酶的表观热稳定性,包括基于与高度类似的热稳定序列的比较进行的合理设计、起稳定作用的二硫键的设计、为了提高α螺旋倾向所作的突变、盐桥的工程改造、蛋白质的表面电荷的变更、定向进化以及共有序列的构成(Lehmann和Wyss 2001)。高热稳定性是这种支架的期望性质,因为它可提高所获得的重组蛋白质的产率,改善纯化的分子的溶解性,改善细胞内支架的活性,降低免疫原性和尽可能减少在制造中需要冷链。
发明内容
本发明提供基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的蛋白质支架、编码核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、组合、制剂、装置以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施例中,蛋白质支架由来自人生腱蛋白C(下文称“生腱蛋白”)的多个FN3结构域的共有序列组成。在又一个优选的实施例中,本发明的蛋白质支架是15个FN3结构域的共有序列。可将本发明的蛋白质支架设计成能结合各种分子,例如细胞靶标蛋白质。
本发明的蛋白质支架可包括另外的分子或部分,例如抗体的Fc区、白蛋白结合结构域或其他影响半寿期的部分。在另外的实施例中,可使本发明的蛋白质支架结合到可编码该蛋白质支架的核酸分子。
本发明还提供至少一种在宿主细胞中表达至少一种基于多个FN3结构域的共有序列的蛋白质支架的方法,所述方法包括将本文所述的宿主细胞在其中至少一种蛋白质支架能以可检测和/或可回收的量表达的条件下进行培养。
本发明还提供至少一种组合物,其包含:(a)基于多个FN3结构域的共有序列的蛋白质支架和/或本文所述的编码核酸;和(b)合适的和/或可药用的载体或稀释剂。
本发明还包括产生基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的蛋白质支架的文库的方法,所述重复序列蛋白优选为多个FN3结构域的共有序列,更优选地为来自人生腱蛋白的多个FN3结构域的共有序列。该文库是通过在该支架的几个部分(例如环区域)中的特定位置改变(通过突变来改变)分子中的氨基酸或氢基酸数目来制备连续几代的支架而形成的。文库可通过改变单环的氨基酸组成或者通过同时改变支架分子的多个环或另外的位置来产生。被改变的环可相应地延长或缩短。可将这种文库产生成包括每个位置处的所有可能的氨基酸或者指定的氨基酸子集。文库成员可用于通过展示进行筛选,如体外展示(DNA、RNA、核糖体展示等)、酵母展示、细菌展示和噬菌体展示。
本发明的蛋白质支架提供增强的生物物理性质,如在还原条件下的稳定性和在高浓度下的溶解性;它们可在原核生物系统(如大肠杆菌)中、在真核生物系统(如酵母)中和在体外转录/翻译系统(如兔网织红细胞溶解物系统)中表达和折叠。
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