[发明专利]利用磁性纳米颗粒和超声技术实现基因转染

说明书

技术领域

此发明是有关于设计用纳米结构组成的运载系统将生物分子传递到指定部位，以及在外加磁场和超声的辅助下将所设计的纳米结构运载系统通过生物膜运送到细胞内的方法。

背景技术

基因转染是用传染媒介转染媒介传染媒介作为传送方式将外来基因物质引入真核细胞。基因转染常常是针对哺乳动物细胞而言，而基因转化则常用于描述DNA植入到细菌和非动物真核细胞，如真菌、海藻和植物中。

现存的基因转染手段必须要克服细胞膜渗透性和转染颗粒溶解性的问题。

药物传送通常涉及到将药物通过细胞膜传输到细胞内。最基本的体内药物运载方法是通过口服或静脉注射将药物引入血液，然后期待药物能被正确的细胞吸收。这种无差别释放技术需要相对大的药物剂量，但是这种单剂量药物运载方法无法用于对基因治疗中所需传递的生物分子比如DNA。

现在的基因转染进入细胞的方法可分为两类：病毒性和非病毒性基因转染。用病毒来将基因转染进入细胞被证明是极其有效的；然而，对进入身体的病毒和诱变物质的免疫反应所引起的后果/副作用特别是临床试验中必须认真考虑，谨慎使用。非病毒药物送达方法包括裸DNA注射和电激发法。但是裸DNA注射的基因转染的效率非常低，而电激法又会导致组织损伤。

显微注射是另一种用精确工具直接将分子注入细胞的机械性方法。对DNA非常管用，但在很多情况下，此方法并不能被大规模使用因为它一次只能转染一个细胞。

基因枪是一个机械设备能将捆绑有生物分子的颗粒通过高压射入细胞。由于这些颗粒的粒径相对较大，所以常常损坏细胞。并且这种方法需要大量注射才有一小部分达到转染效果。

电激法是一种物理方法，它通过电击细胞在细胞膜上产生孔隙。这些孔隙增加了物质扩散进入细胞的几率。使得基因比较容易进入细胞。

超声穿孔法与电激法颇为类似，只是超声穿孔法利用超声来刺激细胞膜。超声对细胞周围的液体产生扰动，从而增加了外界物质通过细胞膜的扩散几率。

磷酸钙转染是另一种基因转染的化学方法，它很便宜。基本原理是用磷酸钙绑在DNA上。这个混合分子能通过细胞膜上的钙离子通道进入细胞；然而这种转染方法的效率通常是不高并且有很大局限性。

病毒传递是一种较有效的方法，因为病毒本身是一种基因信息载体并且擅于进入细胞。这些特点使它们被选择来帮助将DNA分子输入细胞。然而有时病毒载体的应用并不适宜，因为其致敏原性能导致免疫性疾病并有潜在诱导基因突变的危险。更进一步，病毒传递是一种非特定的转染方法并能在宿主身上产生负作用。

另一种方法是用磁场力和分子载体通过细胞膜。此方法已申请美国专利(专利号2007/0231908A1)，此方法需要在穿过生物膜之前将分子载体定向。

对上述大多数方法，基因转染的效果很大程度上取决于被转染的细胞类型。有些细胞比其他细胞更难转染，但这些难转染的细胞，比如干细胞和植物细胞，但通常它们的商用价值很大。

因此，有必要寻找新的手段来传递生物分子或其他有兴趣的分子进入细胞，以克服旧方法所面临的困难。

发明内容

本发明提供了一种用磁性纳米颗粒在外磁场操控下穿过细胞壁/细胞膜实现基因转染/转化的方法。在一个实例中，纳米颗粒被定向通过细胞膜、细胞核膜、或体内细胞膜如血脑屏障。在一实例中，此发明进一步发展是结合超声技术来增加生物膜的渗透性。这种组合的方法能达到更好的生物分子传递或细胞转染/转化效率。

本发明包括如下方面：(a)一种产生无毒，磁性纳米颗粒的方法；(b)将纳米颗粒捆绑在生物分子或其他感兴趣的分子上；(c)在外磁场的作用下，使这些纳米颗粒穿过细胞薄膜。在一实例中，我们用低强度脉冲超声(LIPUS)用于增加薄膜渗透性。

一方面，此发明利用磁性颗粒作为传递载体将特定分子穿透细胞膜带入细胞，此方法包含以下步骤：

(a)将生物分子固定在纳米颗粒上；

(b)将纳米颗粒定位于细胞膜紧邻区域；

(c)对纳米颗粒和细胞膜施加磁场；

(d)并同时对纳米颗粒和细胞膜施加超声。

纳米颗粒表面经过修饰以便于分子附着其上。反应位点的数量随反应位点间距不同而改变。另外，外加分子和纳米颗粒的联接可以是共价键、离子键或其他能将分子固定于纳米颗粒的键合方式。在一实例中，外加分子可以是基因材料如DNA或RNA、蛋白质、或任何其他生物分子。