[发明专利]用于提高5’-鸟苷一磷酸生产力的棒状菌菌株和用其生产5’-鸟苷一磷酸的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及棒状菌(Corynebacteria)菌株，其具有较内源性苹果酸脱氢酶更高的活性，因此能以高产率产生ATP。本发明还与使用该棒状菌菌株结合具有胺化活性的酶或微生物生产5’-鸟苷一磷酸的方法有关。 

【背景技术】

5’-鸟苷一磷酸(在下文中被称作“GMP”)是广泛使用的作为增味剂的食品添加剂，如同肌苷一磷酸(在下文中被称作“IMP”)。GMP引出鲜味(umami taste)，其用途取决于也正被使用的谷氨酸一钠(MSG)。它通常与IMP协同使用以增加MSG鲜味的强度。 

迄今已知的制备GMP的方法的实例包括(1)酵母RNA的酶促降解，(2)直接微生物发酵成GMP，(3)微生物发酵成鸟苷，然后化学磷酸化，(4)微生物发酵成鸟苷，然后酶促磷酸化，(5)微生物发酵成黄苷5’-一磷酸(在下文中被称作“XMP”)，然后通过棒状菌菌株转化成GMP，和(6)微生物发酵成XMP，然后通过具有氨基酶活性的大肠杆菌(Escherichia coli)将XMP转化成GMP。其中，方法(1)具有材料供应的困难和在经济上不是有益的，方法(2)由于GMP的膜通透性而遭受低产率的缺点。因此，其它方法在工业应用中广泛使用。 

对于生产XMP并将其转化成GMP的方法(6)，关键是提供ATP作为辅因子。XMP到GMP的转化中使用的大多数ATP由XMP的生产菌株提供。在该转化方法中，二甲苯起到重要的作用，因为其增加ATP和XMP的膜通透性。培养基中的二甲苯允许ATP和XMP穿透进入GMP的生产菌株，然后将XMP转化成GMP。因此，GMP的生产方法采取增加ATP生产力的策略。 

从XMP到GMP的转化通过以下反应式表示： 

即，充当辅因子的ATP的连续供应对GMP的生产过程是必需的，在该过程中XMP 主要由XMP的生产菌株产生，然后在具有XMP氨基酶活性的酶或微生物存在的情况下转化成GMP。因此，提高XMP的生产菌株的ATP生产力非常重要。在该转化过程中产生的AMP被重新用作ATP生产的底物。实际上，基于腺嘌呤的核苷酸被循环用于ATP的产生。 

因此，提高XMP生产菌株的ATP生产力对高产率的GMP生产是必需的。苹果酸脱氢酶的活性对ATP的产生具有重大影响。然而，前述文件中任何地方都没有提及经设计提高苹果酸脱氢酶活性以增加XMP产率的微生物和方法。 

考虑到，增加XMP生产菌株的ATP生产力以增加GMP产率并且优于两步转化至关重要，本发明人进行了集中研究并发现了引起该增加的基因。并且发现当与XMP氨基酶结合使用时，用串联携带该基因的两个拷贝的重组载体转化的棒状菌菌株能以高产率生产XMP和ATP，从而增加GMP的生产力。 

【发明内容】

【技术问题】 

因此本发明的目的是提供具有较内源性苹果酸脱氢酶更高活性的棒状菌菌株，其因此能以高产率生产ATP。 

本发明的另一个目的是提供生产GMP的方法，包括：培养转化的微生物；在培养物中产生XMP；向培养物中加入具有XMP胺化活性的酶或微生物；和从培养物获得GMP。 

【技术方案】 

根据其方面，本发明涉及较内源性苹果酸脱氢酶活性增强的棒状菌菌株，从而以高产率生产ATP。将本发明的棒状菌菌株进行修饰，以具有较内源活性更高的苹果酸脱氢酶活性，造成ATP的生产力增加。 

如本文所用，术语“苹果酸脱氢酶”，指通过脱氢作用催化苹果酸盐转化成草酰乙酸盐的酶。该酶伴随乳酸脱氢酶在非常广谱的活体生物中被发现，并且需要DPN和NAD作为其活性的辅因子，这些辅因子通常伴随乳酸脱氢酶。在根据本发明的棒状菌菌株中，增加苹果酸脱氢酶活性，从而以较高产率产生ATP，造成GMP的生产力增加。 

如本文所用，术语“内源活性”意欲指野生型微生物中的目标酶活性。术语“高于内源活性”指与内源品种的活性相比酶活性增加，不论起因于由酶自身引起的活性增加还是内源基因或外源基因引起的活性增加。例如，酶活性增加可通过本领域公知 的任何方法实现，包括但不限于，增加或减少基因拷贝数、替换、修饰目标启动子或使目标启动子突变等。