[发明专利]麻风树基因的功能分析

说明书

相关申请的交叉引用

本发明要求于2009年1月9日提交的美国临时专利申请第61/143,484号的优先权，该临时专利申请通过引用并入本文。

发明背景

本发明涉及基因组规模的麻风树属(Jatropha)基因功能分析领域。更具体地，本发明涉及一种利用病毒诱导性基因沉默来进行基因组规模的麻风树(Jatropha curcas)基因高通量功能分析的方法。

本文中用于说明本发明背景或提供有关实施的补充细节的出版物和其他材料并入本文作为参考，并且为了方便起见分别在文献目录中分组。

世界面临着化石燃料供给日益减少和温室作用不断恶化的问题。亟需增加可再生能源的产生和消耗。对于许多国家寻找替代能源来说，生物燃料已经公认为国家的优先项目以满足它们的能源安全需要，同时有助于减少造成温室作用的CO₂排放。对生物燃料的需要导致食物生产的压力增加。例如，为了满足德国政府要求的德国2017年的生物燃料需求，该国的全部农用土地都将用于生长生物能作物，而没有留下土地用于食物生产。为了减轻对土地的这种竞争并满足我们对可再生燃料的需要，亟需利用边缘土地来进行生物能产生。

麻风树是属于大戟科的小木本植物。麻风树的数种独特性质使其成为用于生物柴油生产的理想植物。这些性质包括其迅速生长、容易繁殖、种子的低成本、高含油量、短孕育期、广泛的适应性、干旱耐受性和在退化土壤上茁壮成长的能力。此外，其植株大小使种子的收集非常方便(Jones，1991；Sujatha et al.，2008)。

但是，麻风树具有几个缺点，这限制了它的广泛应用。植物的产量受到不利的雄花与雌花比的限制，并且其含油量没有通过育种进行优化。该植物对生物应激如病毒(Narayanna et al.，2007)、真菌和细菌病原体，和非生物应激特别是寒冷和干旱也是敏感的(http colon www dot jatropha dot org)。在植物的种子和叶子中存在数种毒性组分(例如蛋白毒素、麻风树毒蛋白和致癌剂佛波酯)给麻风树产业的农民和生物加工工人带来健康危害。

改善麻风树的农艺和质量性状的一种重要方法是通过遗传修饰。可以产生表达同源或异源基因序列的转基因麻风树属植物。在许多情况下，期望一个或多个确定功能的同源基因的过量表达或通过RNAi沉默。麻风树属的基因序列可以通过cDNA和基因组文库获得，基因的功能可以通过与其他已知功能的植物基因的序列同源性来初步确定。然而，这种确定充其量只是暂时和初步的。功能确定常常由于成员序列高度相关的基因家族的存在而混淆。基因功能可以通过转基因植物中候选基因的过量表达或RNAi介导的沉默来更准确地确定；然而，这样的方法费力费时并且不适用于基因组规模的高通量分析。

因此，期望开发基因组规模的麻风树基因高通量功能分析的方法。

发明概述

本发明涉及基因组规模的麻风树属基因功能分析领域。更具体地，本发明涉及一种利用病毒诱导性基因沉默来进行基因组规模的麻风树基因高通量功能分析的方法。

本发明涉及利用病毒诱导性基因沉默(VIGS)可靠而迅速，并且以高通量的方式来评价麻风树中的基因功能。在一方面，本发明提供了用于麻风树(J.curcas)中的VIGS的有效且可重复的系统和方法。在一实施方案中，本发明提供了DCL4的共沉默以提高VIGS效率。在另一实施方案中，本发明提供了整个烟草脆裂病毒(TRV)病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方案中，本发明证实这些载体具有与原始载体相似的效率。在另一实施方案中，本发明提供了TRV VIGS系统在克隆和功能性鉴定几种重要的脂肪酸生物发生途径基因中的用途。这些重要的基因可以用于改善生物柴油的燃料特性，如低温流动特性、氧化稳定性和NOx排放。

因此在第一方面，本发明提供了一种麻风树属中的病毒诱导性基因沉默(VIGS)的方法。根据本发明，所述方法包括：

(a)将包含待沉默的第一期望基因的序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体以产生修饰的TRV RNA2载体；

(b)制备土壤杆菌(Agrobacterium)的混合培养物，所述混合培养物包含：土壤杆菌，其含有包含TRV RNA1序列的载体；以及土壤杆菌，其含有所述修饰的TRV RNA2载体；

(c)将所述土壤杆菌的混合培养物通过真空渗入引入麻风树属的植物组织以产生感染的植物；以及