[发明专利]用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用

权利要求书

1.一种能够在哺乳动物宿主细胞内高水平生产源自外源基因的蛋白质的表达载体，包含：

(a)翻译弱化的二氢叶酸还原酶基因盒(翻译弱化的DHFR基因盒)，其表达通过改变密码子为哺乳动物中最不常用的密码子而被弱化；和

(b)基因盒，包含用于将外源基因整合进高转录活性启动子和高稳定性聚腺苷化信号之间的克隆位点。

2.权利要求1所述的表达载体，其中权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子被改变为在人类中最不常用的密码子。

3.权利要求1所述的表达载体，其中将权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子改变为：丙氨酸为GCA，精氨酸为CGA，天冬酰胺为AAU，天冬氨酸为GAU，半胱氨酸为UGU，谷氨酰胺为CAA，谷氨酸为GAA，甘氨酸为GGU，组氨酸为CAU，亮氨酸为UUA，赖氨酸为AAA，脯氨酸为CCA，苯丙氨酸为UUU，丝氨酸为UCA，苏氨酸为ACU，酪氨酸为UAU，和/或缬氨酸为GUA。

4.权利要求1所述的表达载体，其中权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒使用具有低表达诱导活性的启动子作为启动子。

5.权利要求4所述的表达载体，其中所使用的低活性启动子是源自在哺乳动物细胞内几乎不表达的基因的启动子、或者是去除了增强子部分的启动子。

6.权利要求1所述的表达载体，其中权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的启动子改变区域是所述基因盒的全长的30％或更多。

7.一种生产能够高水平生产源自外源基因的蛋白质的转化体的方法，包含将外源基因插入到权利要求1-6任一项所述的表达载体中的步骤和用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞的步骤。

8.一种生产源自外源基因的蛋白质的方法，包含如下步骤：

(a)将外源基因插入至权利要求1-6任一项所述的表达载体中；

(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；

(c)在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中培养转化体；和

(d)从培养的转化体收集源自外源基因的蛋白质。

9.权利要求8的生产方法，其中在权利要求8的培养步骤(c)中使用化学成分确定培养基(CD培养基)或添加了非动物基的添加剂的CD培养基。

10.一种筛选具有高水平生产外源基因的蛋白质的能力的转化体的方法，包含如下步骤：

(a)将外源基因插入至权利要求1-6任一项所述的表达载体中；

(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；和

(c)在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中培养转化体。