[发明专利]用于制备二醇的方法

说明书

本发明涉及用于生物制备二醇的新方法，包括培养经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含用两种酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物脱羧的代谢途径：具有2-酮酸脱羧酶活性的酶和具有羟基醛还原酶活性的酶。本发明还涉及经修饰以供产生脂族二醇的微生物。

背景技术

通过培养产生二醇的微生物而发酵产生此类二醇在本领域是已知的，包括用经遗传修饰以供改善二醇产生的微生物进行的发酵产生。此类二醇的产生描述于下述文献：WO1996/035796、WO2001/012833、WO2004/033646、US7267972及其他。具体而言，已描述了1，3-丙二醇的产生，其涉及维生素B12依存性酶，从而使得生产工艺非常昂贵。

当下对经修饰以从可再生碳源产生二醇和/或对二醇的产生有潜在的促进，特别是具有维生素B12非依存性途径的微生物的备选方案有需求。这些技术改进可在于基于此种产生所必需的能量所产生的产物的总体产率，和最终地，在于为了分离所述产物以及产物的销售和其他用途而有待特别控制的杂质和副产物的水平。

发明内容

本发明涉及经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含供用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基-脂族酸进行脱羧的代谢途径，用具有羟基醛还原酶活性的酶将从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。

本发明的微生物一般选自下组：细菌、酵母和真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。

依照第一个实施方案所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶活性的内源基因。其优选选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Pdc1，Pdc5，Pdc6，Aro10，Thi3)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(Kivd)；丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(Pdc)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Pdc2，Pdc3)；树干毕赤酵母(Pichia stipitis)(Pdc1，Pdc2，Aro10)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Pdc)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。该具有内源2-酮酸脱羧酶活性的微生物可进一步修饰以增强编码2-酮酸脱羧酶的内源基因的表达。

根据本发明的另一个实施方案，所述微生物并不包含编码2-酮酸脱羧酶的内源基因。此种缺乏内源2-酮酸脱羧酶的微生物优选选自大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对于此类微生物，本发明的微生物包含编码2-酮酸脱羧酶的异源基因。

根据另一个实施方案，所述微生物包含编码羟基醛还原酶活性的内源基因。其优选选自大肠杆菌(yqhD，fucO，dkgA，dkgB)；酿酒酵母(ADH1，ADH2，...)；和所有具有至少一种具有醛还原酶活性或醇脱氢酶活性的酶的生物。该具有内源羟基醛还原酶活性的微生物可进一步经修饰以增强编码羟基醛还原酶的内源基因的表达。

用本发明的微生物产生的脂族二醇是具有包含2至6个碳原子，优选2、3或4个碳原子的直链或支化的烷基链的脂族二醇。

在一个优选实施方案中，所述脂族二醇是乙二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是羟基丙酮酸。

在另一个优选实施方案中，所述脂族二醇是1，3-丙二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是4-羟基-2-酮基丁酸。

在另一个优选实施方案中，所述脂族二醇是1，4-丁二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是5-羟基-2-酮基戊酸。

本发明还涉及用于生物产生脂族二醇的方法，包括下述步骤：

-在包含碳源的适当培养基上培养如上和如下所述的本发明的微生物，和

-从培养基回收所述脂族二醇。

根据本发明的优选实施方案，所述二醇经进一步纯化。

发明详述

微生物