[发明专利]人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及人类乳头瘤病毒检测用引物、探针及使用它的人类乳头瘤病毒的检测方法。

背景技术

人类乳头瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)是乳多空病毒科(Papovaviridae family)所属环状双螺旋DNA病毒，能够感染人类及哺乳动物的上皮样细胞，与如疣的引起各种恶性肿瘤的症状密切相关，已知是宫颈癌的重要病因因子。

迄今为止已知的100余种HPV中，在生殖器官中发现了40余种，确认了其中的高危群HPV-16及HPV-18的发展速度比其它的HPV类型快约40％左右，并且其重要性占全部宫颈癌中发现的HPV的约70％左右。另外，HPV-26、HPV-30、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-61、HPV-66、HPV-67、HPV-68、HPV-69、HPV-70、HPV-73等因其发展成为宫颈癌的机率相对较高而被分类为“高危群(high risk group)”，HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-6、HPV-7、HPV-10、HPV-11、HPV-13、HPV-32、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-57、HPV-72、HPV-81等被分类为“低危群(low risk group)”。

另一方面，在全部粘膜皮肤HPV感染中最常见的感染原因是并非与宫颈癌相关的高危群HPV的低危群HPV(HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4)，该低危群HPV通常引起粘膜和皮肤的疣病变。

疣作为HPV感染皮肤或粘膜产生的非常常见的病毒感染性疾病的一种，引起表皮过度增殖，表现为表面凹凸不平的丘疹。在任何部位的皮肤上均有可能发生，但主要发生在暴露部位的手、足、腿、脸等，也可以通过性接触发生在性器官。

通常情况下，疣根据临床类型可分为寻常疣、扁平疣、跖疣及尖锐湿疣。其中尖锐湿疣与宫颈癌相关，对它的研究比较活跃，最近能够预防它的疫苗已实现商业化。然而如寻常疣的常见皮肤疾病由于与致死无关，因此在此期间未受到医生或科学家的关注，事实上与它相关的基础研究几乎成为空白。

HPV感染的诊断方法大致可分为细胞学方法和分子生物学方法。判断HPV感染细胞的形态变化的细胞学方法有巴氏涂片检查法(Papanicolaou(Pap)Smear)，但其诊断的客观性低，而且具有较高的假阴性率(15～45％)，因此存在着不具有一贯准确性的问题。

另一方面，分子生物学方法利用病毒的DNA检测HPV的存在及基因型，大致可分为直接鉴定HPV DNA的方法和利用PCR扩增实施鉴定的方法。该方法能够客观地检测出HPV DNA，诊断准确性显著，在利用细胞学方法不能明确诊断的情况下，具有能够在初期诊断出疾病的优点。

为了直接确认HPV DNA，传统上使用利用HPV类型特异性的探针的如Southern印迹杂交(southern blotting)、斑点印迹法(dot blotting)及FISH(Filter in situ hybridization)的方法，尽管受到FDA认可的二代杂交捕获法(Hybrid capture II)得到广泛使用，但因需要大量的HPV DNA，在HPV初期感染或样品采集稀少的情况下表现出检测限制，并且使用RNA探针因而安全性低，不仅如此还存在着设备比较昂贵、灵敏度降低的问题。

相反地，PCR技术作为能够利用与目标病原体的核酸碱基序列特异性结合的互补寡核苷酸(引物)对微量的病原体核酸进行扩增，检测其是否存在的技术，是多种类型的HPV感染与否的诊断中使用的代表性技术中的一种。上述PCR技术可实现客观的大规模检测，与上述细胞学方法及HPV DNA直接检测法相比，在准确性、易用性及费用方面受到了具有相对优势的评价。

到目前为止，基于PCR的HPV检测法中使用的引物，已开发出与HPV类型无关地使其DNA扩增的通用引物，或是与各种类型特异性结合而仅使型特异性HPV DNA选择性扩增的型特异性引物。