[发明专利]人脐带血来源的间充质干细胞的分离

说明书

发明背景

本申请要求2009年3月31日提交的美国临时专利申请No.61/165.193的优先权，其通过引用并入本文中。

本发明得到由美国国立卫生研究院提供的政府资助5R21AG25466-2。政府享有本发明的部分权益。

1.发明领域

本发明一般性涉及生物学领域。更特别地，本发明涉及用于从脐带血(umbilical cord blood，UCB)中分离和培养间充质干细胞的方法。

2.相关领域介绍

干细胞是当今生物医学最引人关注的领域之一。由于具有自我更新和多谱系分化的能力，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有巨大的治疗潜力。

最近，已提出将脐带血(UCB)作为间充质干细胞(MSC)的替代来源，用于关节炎、心脏病、神经和组织再生领域的干细胞治疗。与骨髓源性MSC(bone marrow-derived MSC，BM-MSC)相比，使用UCB-MSC的优势在于：1)UCB更易于大量获得，并且对其的采集不会对供者产生伤害；2)UCB-MSC具有更高的扩增潜力和更大的分化能力。然而，在研究和临床应用中使用UCB-MSC的主要限制是：UCB中的MSC含量极低(在1×10⁸个单个核细胞(mononuclear cell，MNC)中含有约0.4～30个)，并且UCB-MSC的分离成功率也很低(约30％)。对于干细胞来说，在长期培养中扩增而不损失其干细胞特性是很难的。到目前为止，由于缺乏可识别MSC的特异性标志物，因此利用经典的塑料粘附方法从骨髓或任何其它组织中分离这些细胞。Wolfe等人，2008；Soleimani和Nadri，2009；Kern等，2006。Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow，umbilical cord blood，or adipose tissue.Stem Cells 24：1294-1301。

使用这一方法，UCB中大多数极不成熟的MSC可能不能获得，这是因为它们对塑料的粘附能力较差。最近报道，由骨髓细胞得到的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)增强MSC的附着和增殖，并保留其干细胞特性。Chen等人，2007，JBMR，22：1943。

本发明提供了通过与ECM粘附来分离MSC、促进MSC增殖的方法。使用该系统，可以分离大量的hUCB-MSC，这比先前报道的其他人使用经典的经纤连蛋白或FBS预涂覆的塑料粘附方法分离UCB-MSC的效率至少高1000倍。更重要的是，由ECM获得的MSC在体外形成胚胎小体(embryonic body)(这是胚胎干细胞的独特特征)，并且在体内形成来自3个胚层的组织。

发明概述

本发明提供了通过与细胞外基质(ECM)粘附而从脐带血分离间充质干细胞(MSC)的方法以及用于分离MSC的用途。

在一个方面中，本发明提供了包括如下步骤的间充质干细胞(MSC)分离方法：(a)收集样品；(b)将所述样品接种到经细胞外基质(ECM)预涂覆的培养皿上；以及(c)分离MSC。在一些实施方案中，该方法还包括在接种前对样品离心以收集单个核细胞。

在另一些实施方案中，所述方法还包括植入分离的MSC以获得分化的组织。在另一些实施方案中，该方法还包括植入分离的MSC以获得分化的组织。

在另一些方面中，本发明提供了包括如下步骤的促进MSC增殖的方法：(a)获得分离的MSC样品；以及(b)向ECM上接种该分离的MSC以促进分离的MSC样品增殖。

在另一些方面中，本发明提供了包括如下步骤的产生分化组织的方法：(a)获得分离的MSC样品；以及(b)将分离的MSC植入免疫功能受损的小鼠中以获得分化的组织。

所述样品可来自包含MSC的任何组织或样品。在一些实施方案中，所述样品来自骨膜、骨小梁、脂肪组织、滑膜、骨骼肌、乳牙、胎儿胰腺、肺、肝、羊水、脐带血和脐带组织。在一些特别的实施方案中，样品是脐带血(UCB)。所述样品可来自任何哺乳动物，在一些特别的实施方案中来自人。样品可在任何时间采集。在一些特别的实施方案中，样品在出生后采集。在另一些实施方案中，样品可在出生前采集。

细胞外基质可源自任何合适的来源。在一些实施方案中，细胞外基质源自人骨髓细胞。在一些特别的实施方案中，ECM可包含I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、纤连蛋白、双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖和/或层粘连蛋白。