[发明专利]用于诊断阿维利诺角膜营养不良的引物

说明书

技术领域

本发明涉及用于诊断阿维利诺角膜营养不良（Avellino corneal dystrophy）的实时PCR 引物对和探针，更特别地涉及这种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR 引物对和探针，其能够准确地诊断BIGH3基因外显子 4 中是否存在突变，所述突变是阿维利诺角膜营养不良的原因。

技术背景

角膜营养不良是常染色体显性遗传疾病，其开始在角膜中间具有模糊症状且逐渐蔓延，最终患者到老年时丧失视力。角膜营养不良包括阿维利诺角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、格子状I 型角膜营养不良、里斯-布克乐斯(Reis-bucklers)角膜营养不良等，且由编码βIG-H3蛋白的基因突变引起。

患有阿维利诺角膜营养不良的杂合子患者随着年龄增长似乎出现严重的视力丧失，而纯合子患者从6岁开始似乎完全丧失视力。阿维利诺角膜营养不良是1988年新命名的疾病，从通常称为颗粒状角膜营养不良中划分出来，因为发现它具有分离的症状和遗传基础。同样地，已知它是世界范围内最常见的角膜营养不良，基于遗传分析的韩国1/340至1/1000的患病率（杂合子的情况）表明它是常见的营养不良(Holland, E.J.等,Ophthalmology,99:1564, 1992; Kennedy, S.M.等,Br. J. Ophthalmol.,80:489, 1996; Dolmetsch, A.M.等,Can. J. Ophthalmol.,31:29, 1996; Afshari, N.A.等,Arch. Ophthalmol.,119:16, 2001; Stewart, H.S.Hum. Mutat.,14:126, 1999)。

本发明人发现，如果患有杂合阿维利诺角膜营养不良的患者进行准分子激光原位角膜磨削术(LASIK)，两年后，角膜的浑浊度开始明显扩大且最终引起视力丧失(Jun, R. M. 等, Opthalmology,111:463, 2004)。以前，进行眼科手术期望通过准分子激光原位角膜磨削术或准分子激光手术将使患有角膜营养不良的患者摆脱视力模糊。同样地，即使在韩国，大约已进行30万例准分子激光原位角膜磨削术，其中基于1/1000的患有阿维利诺角膜营养不良的杂合子患者的最低估计，假定有300人丧失视力。 经历准分子激光原位角膜磨削术的患者主要在其20岁及30岁进行生产活动。因此，他们的视力丧失导致严重的社会问题和经济问题。

此外，美国2000年批准准分子激光原位角膜磨削术后，已发现经历准分子激光原位角膜磨削术的患有阿维利诺角膜营养不良的非洲裔美国患者丧失视力，其推断许多相似的病例可发生在世界各地。

因此，尽管为了通过准分子激光原位角膜磨削术预防阿维利诺角膜营养不良的进展，需要准确地诊断阿维利诺角膜营养不良，但仅通过角膜浑浊度的显微观察进行诊断阿维利诺角膜营养不良，因此医生经常遗漏进行准分子激光原位角膜磨削术的患者的潜在症状，其导致视力丧失。因此，快速并准确地诊断角膜营养不良是迫切需要的。

已研发了用于检测BIGH3基因突变的DNA芯片，所述突变是阿维利诺角膜营养不良的原因 (韩国专利早期公开号10-2007-0076532)。然而，使用所述DNA芯片诊断阿维利诺角膜营养不良不利地需要几个步骤，包括样品中扩增DNA的步骤、使扩增的DNA与DNA芯片杂交的步骤、清洗杂交的DNA芯片的步骤和检测阳性反应的步骤。

因此，本发明人已进行大量努力以研发能够更有效地诊断阿维利诺角膜营养不良的方法，结果，已发现，如果使用具有序列号1-2核苷酸序列的引物及具有序列号13-14核苷酸序列的探针通过实时PCR方法诊断阿维利诺角膜营养不良，可以比传统方法更快速并准确的方式诊断阿维利诺角膜营养不良，从而完成本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于使用实时PCR方法提供用于更有效并准确地诊断阿维利诺角膜营养不良的引物对和探针。

为了实现上述目的，本发明提供用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对，其由选自由下列核苷酸序列组成的组的核苷酸序列表示：序列号1-2、序列号3-4、序列号5-6、序列号7-8、序列号9-10、序列号11-12、序列号13-14、序列号15-16、序列号17-18、序列号19-20、序列号21-22及序列号23-24。

本发明还提供了用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR探针，其由选自由序列号25-42组成的核苷酸序列表示。