[发明专利]用于转化植物的改良的培养基组合物、选择方法和农杆菌菌株

说明书

发明背景

本发明涉及通过农杆菌介导的体细胞胚性愈伤组织或胚性悬浮培养物的转化以及使所转化的细胞再生为结实植物来生产转基因植物的领域。具体地，本发明涉及产生大戟科(Euphorbiaceae)转基因植物。本发明还涉及培养基组合物、选择方法和改造的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株，其改善了农杆菌介导的转化效率。

用于说明本发明的背景或提供关于实践的额外细节的出版物和其它材料通过引用并入本文，并且为了方便分别在参考文献中分组。

全世界正面临着日益减少的化石燃料供应和日益加剧的温室效应。对可再生能源的生产和消费的提高存在着迫切的需求。在寻找替代来源以满足他们的能源安全需要并同时帮助减少引起温室效应的二氧化碳排放时，生物燃料已被许多国家公认为是国家优先考虑的事情。对生物燃料的需求已经对食物生产造成了增加的压力。例如，为了满足德国政府授权的德国对生物燃料的需求，在2017年这个国家的全部耕地将不得不用于种植生物能源作物而没有留下土地用于食物生产。为了缓解这种对土地的竞争并且满足我们对可再生燃料的需求，对利用贫瘠土地生产生物能源存在强烈的需求。

大戟科包括有价值的树种，例如橡胶树(Hevea brasiliensis)和麻风树(Jatropha curcas)和蓖麻(Ricinus communis)。若干麻风树独有的特性使其成为用于生产生物柴油的理想植物。这些特性包括生长于贫瘠土地的能力；对水的需求低；非食品作物状态；与棕榈相比(超过3.5年)，在种植后0.5-2年可快速产油。因此，印度尼西亚政府已宣布他们决定在未来五年内将提供约300万公顷土地用于种植麻风树。许多其它亚洲国家正在采用同样大胆的计划。在不同国家中，印度在建立麻风树种植园方面是最先进的。然而，印度麻风树种植园的种子产量低，范围为0.4-12公吨/公顷(与棕榈果实约19公吨/公顷相比)。同样，报告的核油(kernel oil)含量差异很大，从40.4-85.3%(Sun，W.B.，国际麻风树大会，2008，新加坡)。蓖麻油是润滑剂的重要来源并且还是未来生物柴油潜在的来源。

这种差异至少部分归因于对麻风树育种和农场管理缺乏研究。基因工程被认为是作物改良的快速方法。植物转化基本上为两个步骤的过程，即将基因传递入宿主细胞，随后将转化的细胞再生成为植物。体细胞胚性愈伤组织或体细胞胚性悬浮培养物通常被认为是最有效的再生方法，由于大多数转化的细胞已获得成胚潜力，其将很自发地驱使它们发育成体细胞胚。已经公开了用于起始麻风树体细胞胚和维持胚性悬浮培养物的有效方法(国际专利申请号PCT/SG2009/000015；美国临时专利：61/025,430)。

植物转化方法可宽泛地分类为2组：DNA直接转移(例如电穿孔和颗粒轰击)和农杆菌介导的转化。至今，后者已成为转化许多植物所选择的方法。事实上，大多数可商购的转基因棉花和油菜品种源自此方法(Cerdeira和Duke，2006；Dunwell，2000)。之前在玉米(Dunwell，1999；Vega等人，2008；Wang和Frame，2009)、稻(Christou，1997；Hayashimoto等人，1990；Lee等人，1991；Zhang等人，1997)和大豆(Christou等人，1988；Christou等人，1987；Olhoft等人，2003)中的工作显示了将外来DNA引入作物植物的不同方法的实例。转基因植物可在农杆菌介导的转化后获得。这种方法特征在于低频率的转基因产生和形成嵌合体(Gould等人，1991)。转基因植物还可在农杆菌介导的未成熟胚的转化后获得。由于未成熟胚的愈伤组织诱导和植物再生频率通常很高，至今未成熟胚一直是最优选的外植体。转化后，不论DNA传递的方法如何，未成熟胚非常难于再生出可育的植物(Cheng等人，1991)。。另外，在整年内获得未成熟胚通常很困难，并且它们适合于培养的阶段还严格依赖于时间，因此限制了其应用。尽管用未成熟胚转化的频率范围为约0.14%至约4.3%，收回的转基因的数目仍是转化胚数目的一小部分。体细胞胚适合于通过根癌农杆菌和颗粒轰击转化。体细胞胚性愈伤组织可以方便地作为液体培养物维持并且快速扩增以生产克隆群体。因此，一旦建立了优良品种的体细胞胚性培养物，将为开发出聚合有转基因性状的遗传学纯系节省多年的时间。

许多不同的外植体可以与携带有T-DNA载体的农杆菌菌株共培养来产生转基因细胞，所述转基因细胞可以通过体细胞胚发生或器官发生途径再生成正常植物。对麻风树再生和转化的研究一直非常有限。