[发明专利]一种多肽及其衍生物与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及其衍生物与应用，特别是涉及有关抗病毒多肽疫苗的设计方式及应用，具体为抗鸭肝炎病毒多肽疫苗的设计、制备与应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎一年四季均可发生，其发病急、传播迅速和死亡率高。自然爆发时仅发生于雏鸭，发病率可高达100％，主要为3周龄以内的雏鸭，以4-8日龄最为易感；雏鸭的死亡率则差别很大，从20％到100％，随着雏鸭日龄的增长与机体免疫水平的提高，死亡率逐渐降低。4周龄以后的雏鸭发病率和死亡率均很低。成年鸭呈隐性感染，无临床症状且不影响产蛋率，但能排毒。该病可通过消化道和呼吸道感染，主要的传播途径是与病鸭的直接接触感染，也可通过病鸭的粪便、食具、饮水等间接传播。目前，对鸭病毒性肝炎病还缺少特效药物，因此重在预防。同时，在国内市场上还没有获得批准的针对鸭病毒性肝炎的有效疫苗(包含活疫苗和灭活疫苗)，因此开发预防鸭肝炎病毒的疫苗无论从安全性和实用性均更切合需求。

传统疫苗包括能诱发免疫力却不致病的灭活疫苗和减毒疫苗，但由于在制备该类疫苗时，需要足够多的活病毒做灭活或减毒处理，在这一过程中如果操作不当将存在严重的安全隐患。

多肽疫苗是根据病毒蛋白或从病毒基因组编码的蛋白中选取具有抗原表位特性的多肽片段，通过采用化学合成技术制备出抗病毒多肽疫苗。由于多肽疫苗完全是人工合成，不存在毒力回升或灭活不全的问题，在制备和使用的过程中不存在传播的危险，因此消除了以往灭活疫苗或减毒疫苗存在的安全隐患。

发明内容

本发明提供了一种多肽疫苗的设计方式及其衍生物的应用，其目的是提供一种对病毒性疾病的预防所采取的一项措施。采用病毒蛋白中具有抗原表位特性的多肽片段制备抗病毒多肽疫苗以抵抗病毒对机体的侵害，具体到采用此设计方式制备抗鸭肝炎病毒多肽疫苗为实例，阐述多肽疫苗的设计与应用。

法氏囊是鸟类动物所特有的免疫器官，是B淋巴细胞最早发生的场所，对B细胞的发育、成熟和迁移具有重要作用。1986年人们首次从鸡法氏囊抽提液中纯化出一种三肽物质，赖氨酸-组氨酸-甘氨酰胺(Lys-His-Gly-Amide，或KHG-NH₂)并被命名为囊素。囊素主要是由法氏囊滤泡的上皮细胞合成和分泌。囊素不仅存在于鸟类动物的法氏囊中、胸腺Hassall小体中、腔上囊中，而且还广泛存在于哺乳类动物(包括人)的骨髓和肝胆上皮细胞中，它对鸟类动物及哺乳动物的体液免疫和细胞免疫具有重要的促进作用，具有促进B淋巴前体的分化、增殖、提高巨噬细胞的吞噬能力，显著提高B淋巴细胞应答和免疫功能的作用(江倩等“囊素的研究进展”，中国畜牧兽医文摘2007年，第3期36页)。

根据获得的鸭肝炎病毒基因组信息，根据其编码的蛋白从中选取具有抗原表位特性的多肽片段。本发明采用将多拷贝病毒多肽抗原片段通过具有双活性氨基的赖氨酸与生物活性分子囊素相连接，使合成产物不仅克服了单一拷贝病毒多肽抗原片段分子量低，抗原性差的缺点，同时通过囊素提升机体免疫功能，使囊素与多肽抗原产生协同作用，提高机体对多拷贝多肽抗原的免疫应答反应。

氨基酸的特点是具有一个氨基和一个羧基，比如甘氨酸(Gly，或G)的氨基与赖氨酸(Lys，或K)的羧基经活化后进行缩合反应，使Lys与Gly形成肽键相连接形成Lys-Gly合成产物。多肽固相合成的原理是将所要合成的目的多肽的羧基末端氨基酸的羧基与固相树脂共价连接，使该氨基酸的氨基被活化后再与所需要连接的氨基酸的活化羧基进行缩合反应(连接上羧基末端的第二个氨基酸)，如此反复多次地进行下去。因此固相肽合成的顺序是从多肽的羧基端向氨基端逐个氨基酸地连接延伸肽链，待合成结束后将合成多肽从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱分离纯化后可得到高纯度的多肽合成产物。由于多肽固相合成技术目前已经非常成熟并有多肽自动化合成仪辅助，有关合成步骤和方法在此不再累述，参见“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach”；W.C.Chan(Editor)，Peter D.White(Editor)；Publisher：OxfordUniversity Press，New York，USA；1Edition(March 2，2000)。由于多肽合成工艺稳定，因此不仅能够高纯度、大批量地制备抗病毒多肽疫苗，而且由于疫苗的整个制备过程中杜绝了与活病毒的接触，有效避免了病毒的污染和扩散，使疫苗制备和应用过程中安全性得到了有效保障。