[发明专利]一种PCR荧光分子信标探针技术定量检测人类白细胞抗原B27基因的方法

权利要求书

1.一种以人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因为检测目标的PCR荧光分子信标探针定量检测技术，包括以下步骤：

a、在HLA-B27基因中选择一段小于150bp的片段做为靶序列，合成一对引物；

b、根据靶序列中位于两个引物之间的序列，设计合成一个荧光分子信标探针，其淬灭基团为DABCYL，荧光基团为FAM；

c、构建一个引物与靶序列完全相同、片段长度与靶序列长度相似，但序列内容与靶序列不同的内参标准品。并根据内参标准品的序列，设计合成一个荧光分子信标探针，其淬灭基团为DABCYL，荧光基团为ROX。

d、提取待测标本中的DNA，使用步骤a中的引物、步骤b中的探针、步骤c中的内参标准品及其探针，与其它PCR反应体系成分混合，进行PCR反应，扩增靶基因片段和内参标准品片段。

e、分别检测反应结束后的FAM和ROX荧光值，根据各自外标曲线计算靶序列和内参标准品的反应终拷贝数。

f、根据内参标准品的起始拷贝数和反应终拷贝数计算PCR扩增效率，根据靶序列的终拷贝数和PCR扩增效率计算靶序列的起始拷贝数。

2.权利要求1所述的PCR荧光分子信标探针定量检测技术，其特征在于所述的待测核酸为人类白细胞抗原B27基因第5外显子及其前后DNA序列共142bp。

所述的特异性核酸序列(Seq 1)为：

1   TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC CGTCTTCCCA GTCCACCGTC CCCATCGTGG

51  GCATTGTTGC TGGCCTGGCT GTCCTAGCAG TTGTGGTCAT CGGAGCTGTG

101 GTCGCTGCTG TGATGTGTAG GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA

所述的引物序列为：

引物1(Seq 2)：5’TTC CCT TCC TTT CCC AGA G 3’

引物2(Seq 3)：5’TTC CCTACC TGAGCT CTT CCT 3’

所述的荧光分子信标探针序列(Seq 4)为：

5’CAG GCT CGT TGT GGT CAT CGG AGC TGT GGT GAG CCT G 3’

3.权利要求1.c所述的内参标准品，其特征在于所述的核酸为人类β-Actin基因第4外显子部分DNA序列与权力要求2所述的引物序列构建的片段，共142bp。

所述的内参标准品核酸序列(Seq 5)为：

1   TTCCCTTCCT TTCCCAGAGC GTACCACTGG CATCGTGATG GACTCCGGTG

51  ACGGGGTCAC CCACACTGTG CCCATCTACG AGGGGTATGC CCTCCCCCAT

101 GCCATCCTGC GTCTGGACCT GAGGAAGAGC TCAGGTAGGG AA

所述的内参标准品荧光分子信标探针序列(Seq 6)为：

5’CAG GCT CCC CAC ACT GTG CCC ATC TAC GAG AGC CTG 3’

4.权利要求1所述的PCR荧光分子信标探针定量检测技术在血细胞、组织细胞、人体液中脱落细胞等各种样本的检测。