[发明专利]一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药提取技术领域，尤其是涉及一种从眼镜蛇蛇毒中提取神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)的方法。

背景技术

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是迄今为止发现的唯一不仅对中枢及外周神经的正常神经细胞有营养因子作用，而且具有调节损伤神经修复机能的生物活性分子。神经生长因子在临床上有重大的应用价值，目前的适应症主要包括各种外周神经病、视神经损伤、脊椎损伤、颅脑损伤、中枢神经系统缺氧和缺血造成的损伤及早老性痴呆等。NGF可以从蛇毒、人胎儿脑髓、人胎盘及雄性小鼠的颌下腺中提取，也可以通过基因工程的方法制备。其中，基因工程表达是制备NGF的趋势，但由于神经生长因子须在CHO细胞等真核细胞表达系统中才有较好的生物活性，技术难度大，形成工业化生产尚有相当长的时间。而人胎儿脑髓、人胎盘等组织来源困难、成本高；雄性小鼠颌下腺原料成本高并且有动物组织污染的风险。

通过人工养殖毒蛇，蛇毒原料来源稳定，成本低。同种毒蛇所产蛇毒性质均一，原料的稳定性高。并且避免了破碎生物组织产生污染源的可能。

原有的眼镜蛇蛇毒神经生长因子的制备方法，是将眼镜蛇蛇毒原料溶于50mM Tris-HCL，pH 7.0加有蛋白酶活性抑制剂的溶液中，离心后上清液上样到用溶解原料的溶液平衡好的Sephadex G-100的分子筛层析柱，收集活性部分，透析交换缓冲液到NaAC，pH 5.0的缓冲液，将交换完缓冲液的样品上样到透析缓冲液平衡好的CM-52柱，NaCL溶液梯度洗脱，收集活性部分，将活性部分上样到含NaCL溶液，pH5.0，50mmol/L的NaAC溶液平衡好的Sephadex G-100层析柱，收集活性部分，即为眼镜蛇蛇毒神经生长因子。

此制备过程采用的是羧甲基纤维素阳离子层析介质(CM-52)，此介质在使用过程中由于流速太慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变，而且不能承受0.1M以上的NaOH在位清洗，重生效果差，若用于规模化生产，则会影响效率。Sephadex G-100层析介质的刚性差流速慢，承受压力后容易变形使流速更慢并且影响分离效果。交换缓冲液使用透析技术，速度慢、透析过程终点不容易掌握，溶液用量大，不适于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种生产周期短、生产效率高、采用超滤替代透析以及使用高流速、高载量的离子交换凝胶CM Sepharose FF和高分辨率的分子筛凝胶Superdex 75prepgrade来制备眼镜蛇蛇毒神经生长因子适于规模化生产的方法。

本发明的目的是这样实现的，一种适于规模化生产的眼镜蛇蛇毒的神经生长因子的纯化方法，其特点在于：

1)将冻干的眼镜蛇蛇毒干粉溶于水后加入硫酸铵，使其成为50～60％的硫酸铵溶液，待其充分混匀后，静置30min，10000rpm离心30min，收集上清液，

2)选用截留分子量为3k～5k的超滤膜包将上清液超滤交换缓冲液为pH 5.0的50mMNaAc溶液；

3)将完成缓冲液交换的上清液过0.22μm滤膜，除去杂质颗粒和细菌；

4)将过膜后的上清液上样于pH 5.0浓度为50mM的NaAc缓冲溶液平衡好的CM Sepharose FF层析柱，流速5ml/min，上样完毕，在8倍柱体积内将缓冲液中的NaCL浓度从0升至0.5M，直线梯度；

5)收集上步骤中的具有NGF活性的蛋白，用3K超滤膜膜包将蛋白溶液浓缩；

6)浓缩后的目的蛋白上样于含0.15mol/L NaCL溶液，pH7.520mmol/L的Tirs溶液平衡好的Superdex 75prep grade柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即为眼镜蛇蛇毒神经生长因子原液。

本发明方法与原有方法相比大大缩短了生产周期，提高了处理量和得率，适用于规模化生产。

用硫酸铵溶液处理蛇毒，沉淀了原料中的大量杂蛋白，为后续的离子交换步骤减轻压力，提高了处理量，采用此法的优点是：

1、周期短，整个沉淀过程只要一小时，大大低于采用层析法所需要的时间。

2、要求低，整个过程中只需要硫酸铵一种辅料，且不需特殊设备。

3、效果好，能在短时间内去除多达约50％的杂蛋白。