[发明专利]细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建与应用，属于生物技术领域。 

(二)背景技术

禽白血病病毒囊膜糖蛋白基因(ALV-env)编码的囊膜糖蛋白(env)包括囊膜表面蛋白gp85和穿膜蛋白gp37，两者在宿主细胞内先是形成gp85-gp37聚合前体蛋白，再经加工剪切形成成熟的囊膜糖蛋白gp85和gp37。ALV-env基因编码的囊膜蛋白是该类病毒的主要表面蛋白。该囊膜蛋白与靶细胞表面特异性受体相互识别、结合，是病毒进入靶细胞进行复制、增殖所必需的。 

pLenti7.3质粒是Invitrogen公司利用HIV基因片段等构成的慢病毒病毒真核表达质粒载体(Lentiviral vector)。pLenti7.3质粒可将重组到其多克隆位点的目的基因导入到被转染的宿主细胞核并整合到宿主细胞染色体中。pLenti7.3质粒可将其HIV长末端杂交启动子(RSV/5’LTR)到SV40pA之间的DNA序列转录成一条长的mRNA，然后反转录成cDNA。此部分DNA序列在整合到宿主细胞染色体中后，在CMV启动子的作用下可在宿主细胞核中转录插入的目的基因，在细胞浆中表达目的基因；同时表达pLenti7.3携带的绿色荧光蛋白(EmGFP)。 

(三)发明内容：

本发明的第一个目的是将PCR扩增获得的ALV-env基因与慢病毒表达载体重组构建一种可在细胞膜上表达ALV-env蛋白的荧光真核转基因表达质粒(pLenti7.3/ALV-env)，该质粒含有ALV-env基因。 

本发明的另一个目的是细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒在制备禽白血病假病毒中的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其ALV-env蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

一种细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒是利用含启动序列的特异性引物：上游引物：5’ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC 3’；下游引物：5’GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG 3’，通过PCR方法从禽白血病病毒基因组(从鸡胚成纤维细胞培养物中提取)扩增env基因。禽白血病env基因与商品化pLenti7.3表达质粒重组，构成细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒(pLenti7.3/ALV-env)。含有pLenti7.3/ALV-env质粒的大肠杆菌，已于2009年11月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：3415，分类命名大肠埃希氏菌Escherichia coli。 

本发明还包括上述细胞膜表达ALV-env蛋白荧光表达转基因质粒在禽白血病假病毒上的应用。 

细胞膜表达ALV-env蛋白荧光表达转基因质粒被转染到宿主细胞(如HEK293细胞)后，env基因可表达禽白血病的囊膜蛋白，并定植到宿主细胞膜表面，同时在宿主细胞浆中表达报告基因—绿色荧光蛋白。将ALV-env基因和绿色荧光蛋白基因(EmGFP)整合到宿主细胞染色体中，并在宿主细胞膜表面表达出禽白血病的囊膜蛋白，同时在宿主细胞浆中表达报告基因—绿色荧光蛋白。利用这种出现绿色荧光并在细胞膜上表达ALV-env蛋白的HEK293细胞，借助辅助质粒(pLP1、pLP2，Invitrogen公司)可制备禽白血病假病毒。 

制备出的假病毒可用于检测禽白血病病毒(ALV-J亚型)的中和抗体：当待测样本中具有足够量的抗ALV-J亚型中和抗体时，可阻止该假病毒与宿主细胞结合，当样本无抗禽白血病病毒(ALV-J亚型)中和抗体或中和抗体较少时，该假病毒可与宿主细胞结合，24小时后在荧光显微镜下检测宿主细胞有无绿色荧光，如有可发出绿色荧光的宿主细胞则说明样本中没有中和抗体，样本检测结果为阴性；如无可发出绿色荧光的宿主细胞(阴性对照样本细胞可发出荧光)细胞则说明样本中有中和抗体，样本检测结果为阳性。 

本发明的有益效果是：利用本发明构建的pLenti7.3/ALV-env质粒与辅助质粒共同转染HEK293细胞，制备ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒进行中和试验，避免了活ALV病毒对环境的污染。由于假病毒可自发发荧光，在中和实验中可以省略荧光抗体染色部分，减少非特异性荧光反应。 

(四)附图说明