[发明专利]一种骨植入材料的脱钙方法

说明书

技术领域

本发明涉及骨植入材料的处理方法。

背景技术

骨植入材料是指一类含钙质较高的、可以代替骨骼和用于骨骼再生的材料，可以是人工合成的“生物陶瓷”，或者是自然界中的类似代替物如“珊瑚石”，或者是异体供者的衍生骨(经脱脂脱蛋白的尸体骨或动物骨)，这些材料均可以作为骨植入材料代替缺损的骨骼并诱导骨骼的再生，最终形成的理想骨骼内部应当包括骨细胞和富含钙质的细胞外基质、胶原、血管、神经，甚至骨内膜、骨外膜、骨髓腔等结构。

骨植入材料含钙量高、硬度高、透光性差，需要对其进行处理和切片才能进行组织学观察。现阶段对于此类材料的组织学观察处理主要有三种途径：(1)脱钙后常规石蜡包埋切片；(2)不脱钙塑料包埋硬组织切片；(3)脱钙后常规冰冻切片。由于坚硬的骨植入材料与其中生长的细胞、血管等软组织属于不同的性质，为了便于制备结构清晰、完整的薄切片观察，常规处理方法多以强酸脱钙(使之整体变软)后常规石蜡包埋制片或常规冰冻切片，少数方法选择不脱钙而用塑料包埋(使之整体变硬)后以硬组织切片机制片。然而，上述处理方法存在难以避免的缺陷，包括：(1)强酸脱钙会导致部分蛋白变性，影响后续的研究；(2)常规石蜡包埋难免对组织存在一些热损伤，而一般的塑料包埋半薄切片也会抑制抗原抗体反应，使之难以进行某些免疫组织化学染色的观察和研究；(3)更为重要的是，原先依附于坚硬骨植入材料生长的软组织脱钙后由于失去坚硬组织的支撑，离开了原有的位置、失去了原有的结构，对相关形态学和机制研究造成困难；(4)如进行不脱钙切片，不仅制片成本高昂、费时费力，且因为切片很厚，难以进行精细的观察。

为了克服上述缺陷，有的研究者制备不脱钙的骨组织冰冻切片，进行常规染色和免疫标记染色的观察，虽然效果较好，但是此类冰冻切片也存在如下问题：需要特制仪器，且费用十分高昂，仅见日本、德国等有个别报道；更重要的是，此类冰冻切片不适用于植入体内之前或植入体内较短时间的骨植入材料，因为此时骨植入材料内部的骨胶原、骨细胞、血管和神经等很少，材料很脆，不脱钙直接进行切片时材料会崩解破碎，无法完成制片和其内部结构的观察。

蒲权教授的塑料包埋技术是一种经改良的骨和骨植入材料处理方法，将具有一定硬度的塑料填充在骨和材料的空隙中及其周围，无需脱钙，即可用该法制备的塑料块制片，切片能较好地保持蛋白的免疫活性，进行多种免疫组化(抗原抗体)反应，但该法也存在一些问题：(1)只适用于小组织(直径2-3mm以下)，此时可用普通切片机配合特制的钨钢刀(价格较贵)制片，如用于更大组织则需要特殊的硬组织切片机(这类仪器价格十分昂贵，在国内只有少数单位有)；(2)塑料包埋剂在常规条件下无法充分进入材料内部，因而材料内部会形成气泡，切片时会导致材料崩解和材料上的细胞丢失；(3)其所用的固定剂可使蛋白变性，从而使得绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)等的荧光消失，故无法用于观察材料内部的荧光细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，使骨植入材料在脱钙时将所负载的细胞保留在原位、维持原有的形态并最大限度地保持组织和蛋白的免疫活性。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种骨植入材料的脱钙方法，该方法包括以下步骤：

(1)取骨植入材料，用4％多聚甲醛或10％的甲醛浸泡固定；

(2)将固定后骨植入材料浸泡于半固体原液中，静置至形成半固体；

(3)将埋在半固体中的骨植入材料置于湿度为100％的环境下脱钙至骨植入材料结构消失或无坚硬成分；

步骤(2)中所述的半固体原液由以下方法制备得到：取脱钙剂和半固体赋形剂，加入到磷酸缓冲液、生理盐水或水，溶解形成均匀的半固体原液；

所述的脱钙剂为临床病理检查中常用的脱钙剂，如EDTA、甲酸、乙酸、盐酸等；当选用不同脱钙剂时，其在脱钙体系中的浓度也有所不同，这是本领域普通技术人员应掌握常规技术，如当脱钙剂为EDTA时，EDTA在所述半固体原液中的浓度为0.05g/mL～0.15g/mL；当脱钙剂为甲酸时，甲酸在所述半固体原液中的浓度为4％～15％(v/v)。本发明人发现，当0.05g/mL～0.15g/mL EDTA和2％～8％(v/v)甲酸的混合物为本发明脱钙体系的脱钙剂时，脱钙效果最好，所需时间也较少；

所述的半固体赋形剂可以为琼脂，其在所述半固体原液中的浓度为0.004～0.005g/mL；

所述的半固体赋形剂也可以为海藻酸钠，其在所述半固体原液中的浓度为0.05g/mL～0.3g/mL，其中0.18g/mL～0.23g/mL的浓度比较适合形成半固体脱钙体系。