[发明专利]一类荧光染料、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及精细化工领域中一类新的荧光染料、制备方法及其应用，特别是涉及一类单电荷含氮菁类荧光染料、其制备方法，以及利用该荧光染料、其缀合物或其组合物在生物染色方面的应用。

背景技术

荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(A0)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等商品化荧光染料在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，这些染料都各自存在着应用的局限性。其一主要表现在大多荧光染料受限于固定细胞样品。例如TOPRO、TOTO家族染料、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响[Kozubek S，Lukasova E，Amrichova J，Kozubek M，Liskova A，Slotova J.Anal Biochem 2000；282：29 38]。同时，溴乙锭等吖啶，菲啶类染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，如能够专一识别脱氧核糖核酸(DNA)的荧光染料4’，6-二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、Hoechst33258，Hoechst34580等，与DNA结合后，在紫外光激发放下产生蓝色荧光。由于紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中的使用受到光激发时间的限制[Davis SK，Bardeen CJ.Photochem Photobiol 2003；77：675-679]。此外，在紫外区进行荧光检测时，生物样品在这个区间的吸收使光进入生物组织内部变得困难，同时生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使检测效率大大降低。因此，研究开发出具有良好荧光光谱性能，毒性小，活细胞通透性的新型荧光染料仍然是推动荧光分析技术和生命科学等领域发展的关键和核心。

在众多种类的荧光染料中，菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电转换材料等已被广泛的应用。其中喹啉类不对称菁类荧光染料与核酸有高度亲和力，而与其他生物大分子基本不结合的特异性使其在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域的应用中脱颖而出。该类化合物与核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽结合。具体的结合方式与结合能力取决于该标识物的结构及其与核酸浓度的比例。不对称菁类化合物中最典型的为TOTO及其类似物(YOYO)和衍生物类(TOPRPO)。TOTO(噻唑橙二聚体)、YOYO(恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链的长度和两端的芳香母核(噻唑、恶唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的结构可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液中几乎无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。Jason等用溶液粘度测定法和原子力显微镜解释了TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用[J.A.Bordelon，K.J.Feierabend，S.A.Siddiqui，L.L.Wright.J.Phys.Chem.B，2002，106，4838-3843]。Fürstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计数法进一步阐述了荧光增强的动力学机理。[A.Fürstenberg，M.D.Julliard，T.G.Deligeorgiec，N.I.Gadjev.J.AM.CHEM.SOC.，2006，128，7661-7669]此类染料中的有些品种已经商品化了，如：SYTOX Blue，TOTO，POPO，BOBO，YO-PRO等。但这些商品化的染料大部分分子较大，结构复杂，属活细胞非通透性，只能应用于活体外核酸的识别与检测。

发明内容

因此，需要开发新的荧光染料，该荧光染料应当具有以下优点：在不存在核酸时具有较低的荧光背景，与核酸结合后具有较高的荧光量子产率，且对核酸以外的生物分子无亲和力；具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性；光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。

在本发明的第一方面，本发明针对现有技术的不足，在其基础上改进，提供了一类结构简单、灵敏度高、长波长、且具有良好的细胞膜通透性的新化合物，其具有下列结构通式I：