[发明专利]一种人鼠同源性Caspase-3的小RNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因领域，涉及小RNA干扰及其应用，具体涉及抑制人及大鼠的Caspase-3表达的小RNA及其在制备治疗慢性疼痛药物的应用。

背景技术

慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一，其生理学特点是痛觉的反应性增高，主要表现为痛觉过敏(hyperalgesia)和超敏反应(allodynia)。此类疼痛治疗困难，主要是由于其机制不明。目前在治疗上，主要是以吗啡为代表的阿片类受体阻滞剂，但存在众多的副作用以及成瘾、耐受等反应，从而限制了其长期使用。

Joachim Scholz、Hassanzadeh P在2005年、2006年分别有神经病理性疼痛及炎症性疼痛模型上发现神经元凋亡有的报道，推测神经元凋亡可能是引起神经病理性疼痛的原因之一。细胞凋亡(apoptosis)是一个细胞自我破坏的程序性生化过程，最终都通过蛋白酶Caspases介导蛋白裂解起作用，Caspases一部分是对前凋亡信号作出反应的启动者(initiators)，主要包括caspase-2、8、9、10，另一部分作为凋亡的效应者(effectors)，主要包括caspase-3、6、7，而在神经系统中，caspase-3起关键作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因沉默的现象，是生物体内抑制特定基因表达的一种现象。外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA将被RNase III家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer，以ATP依赖的方式逐步切割为19～23nt的小分子干扰RNA片段(smallinterfering RNAs，siRNA)。siRNA双链在RISC作用下双链解开，同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目标mRNA切断，从而阻断了基因表达。RNA干扰是目前最有效的基因“沉默”技术，从理论上讲，在慢性疼痛通路中兴奋性增高的基因都可能成为RNA干扰靶位，从而降低其兴奋性，达到治疗目的。但是，干扰效率高，特异性强的小RNA的获得较难，不同序列的差异即可导致有效性的丧失，从而影响其药理学的价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人鼠同源性Caspase-3的小RNA，以及它在制备治疗慢性疼痛药物中的应用

我们经过筛选，获得人及大鼠同源性的caspase-3小RNA，可同时对人及大鼠的caspase-3mRNA进行降解，从而抑制人及大鼠的Caspase-3蛋白的表达，通过抑制细胞凋亡减轻疼痛，可以成为治疗慢性疼痛的一种新的药物。

具体技术方案是：大鼠caspase-3基因序列由Gene bank获得，序号为NM 004346，全长为2484bp。人的caspase-3基因序列由Gene bank获得，序号为NM 004346，全长为2689bp。再将其相同序列中的开放读框部分输入http://i.cs.hku.hk/～sirna/software/sirna.php网站所提供的RNAi设计软件进行在线筛选，而后选择GC比在40％-60％之间的，位于开放读框内的5个不同的序列，如下：

AGCCGAAACTCTTCATCAT

GATACCAGTGGAGGCCGAC

TACCAGTGGAGGCCGACTT

GTCGATGGACTCTGGAATA

ACCTCCGTGGATTCAAAAT

我们从中选出三个序列构建表达载体pShuttleH1-siCas3，同时构建含caspase-3基因的pEGFPC1报告质粒，用脂质体方法将pShuttleH1-siCas3和pEGFPC1-Cas3共转染293细胞，进行RNA干扰效率的检测，进而筛选出RNA干扰效率最高的序列：GATACCAGTGGAGGCCGAC，对应的RNA序列为：GAUACCAGUGGAGGCCGAC。

本发明提供了一种人鼠同源性Caspase-3的小RNA，其序列是GAUACCAGUGGAGGCCGAC(如SEQ ID NO：1所示)。