[发明专利]适于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基

说明书

【技术领域】

本发明涉及现代生物技术之培养基研发技术领域，具体地说，是一种适 于MDCK细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无血清培养基。

【技术背景】

防止病毒危害人类是各国都非常关心的事情。多少年来，人类每年因病 毒的侵害而蒙受巨大的损失，如狂犬病、禽流感对人类的危害。狂犬病是由 狂犬病病毒引起的，是危害非常严重的传染疾病之一，一旦发病，死亡率非 常高，而且至今除预防的疫苗外没有特殊有效的治疗药物。此外，流感病毒 引起的危害也非常大，每年都会有5～15％的人被季节性流感感染，有300～ 500万个严重病例，有高达50万人因之死亡。更为严重的是，现在的流感病 毒变异后可由禽类传染给人，禽流感就曾肆虐了全球多个国家，给人类造成 了严重危害。有调查表明，1989年法国因流感而消耗的卫生服务费约为19亿 法郎，潜在的经济损失为143亿法郎。美国每年因流感而导致的直接经济损 失为10～30亿美元，潜在的经济损失为100～150亿美元。中国香港地区因 禽流感损失估计高达8000万港币。由此可见，防止病毒危害人类是项重要而 紧迫的工作。

目前已上市的流感疫苗基本上都是用鸡胚培养制取的。鸡胚在疫苗的生 产中被用作培养介质，使用的鸡胚必须要能保证培养病毒的存活，属于病毒 生长所需的特殊环境。因此，一般须使用健康鸡群产下的受精卵，要求产蛋 鸡的年龄不能超过1岁，同时，必须对鸡群进行定期检测，确保在生长过程 中不受相关疾病的影响，确保受精卵内也不存在任何病毒。由于受到这些因 素的限制，所以鸡胚的供应量一直较小。由于鸡胚带有潜在污染的可能，且 培养周期长，不易控制产量，不利于大规模应用，因此，美国等一些国家和 世界卫生组织都鼓励发展细胞培养技术以替代目前的鸡胚培养技术用于流感 疫苗的生产。

应用动物细胞成规模生产流感疫苗，是将病毒适应到传代细胞，并在生 物反应器上进行大规模的病毒繁殖和培养以实现流感疫苗的规模化生产，其 优点主要是：(1)可完全避免鸡胚中的蛋白质引起的不良反应，有利于提高 疫苗质量；(2)克服鸡胚要求严，来源少的问题，可降低生产成本；(3)细 胞培养体系易于放大，且病毒繁殖快，更易满足市场的需求。

目前以细胞培养制备疫苗最为广泛的是Vero、MDCK和PER.C6三个细胞 系。其中的MDCK细胞是一种非常重要的动物细胞系，它可以用来生产弱化的 病毒，进而用于病毒疫苗的生产，如流感和狂犬病疫苗的生产。用MDCK细胞 生产疫苗有很多优点：首先，MDCK细胞培养容易，增殖快，生产周期短，易 于放大；其次，与鸡胚生产的病毒相比，用MDCK细胞生产的病毒与从人体分 离的病毒更加相似，性质更均一，病毒表面糖蛋白不易发生变异，感染效率 高；再次，用MDCK细胞生产的疫苗也适用于对鸡胚蛋白过敏的患者；最后， 由于生产过程中不涉及人的细胞和动物个体，不会引起伦理学纷争。

但是，传统的MDCK细胞生产疫苗的过程需要用血清。使用血清有几个明 显的缺点：首先，因动物个体不同，血清产地、批号不同，血清的批次质量 差异甚大，使得实验和生产的标准化困难；其次，血清的成分复杂，其中既 含有促进一些细胞生长的成分，也含有抑制另一些细胞生长的成分，并且还 含有对细胞产生毒性的物质，如补体、抗体、细菌毒素等，会影响细胞的生 长，甚至造成细胞的死亡；再次，在血清的取材中可能带入支原体、病毒， 对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；第四、应对 大规模生产时，血清的来源越来越困难，且价格昂贵；最后、血清的引入还 会加大产品下游分离纯化的困难，增加生产成本，很难实现规范生产，并可 能带来安全隐患。

现在，由于在强力推行GMP规范，有血清的细胞培养系统将会失去其应 用的市场，因此，迫切需要开发MDCK细胞的无血清培养基。

用无血清培养基进行细胞培养从1911年就开始研究了，目前多数细胞已 经能在无血清培养系统中正常地生长和增殖。MDCK细胞的无血清培养基近些 年也有了很大的发展。

1979年Mary Taub等人开发出的MediumK-1无血清培养基能支持贴壁的 MDCK细胞生长，但该培养基含多种激素和生长因子，成分复杂。1994年法国 的O.-W.Merten等人开发了无血清培养基MDSS2，1996年对其改进后得到 MDSS2N(用植物来源组分代替动物来源组分)。这两种培养基均可用于MDCK 细胞贴壁培养，但是细胞生长慢，延滞期长(约48小时)，不能达到很高的 细胞密度。