[发明专利]人类病原体艰难梭菌中乙酰辅酶A合成酶的抑制剂

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及作为人类病原体艰难梭菌中乙酰辅酶A合成酶(ACS)抑制剂。

背景技术

艰难梭菌(clostridium difficile)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，能产生毒素A和毒素B，进而导致腹泻、假膜性结肠炎和结肠癌及其它严重疾病，统称为CDAD。这种病多发于在医院里服用了抗生素的病人，在北美和欧洲已流行多年，病例年年增加，仅以美国为例，CDAD的诊断病例在2001-2005的4年间增长了1倍，2006年报道的病例高达300,000例。近年来CDAD已经蔓延到澳大利亚和亚洲的日本、中国台湾等地，并且有向全世界范围内扩散的趋势。

目前，用于治疗CDAD的药物主要是两种口服抗生素：万古霉素和甲硝唑。万古霉素已经被美国FDA批准为CDAD的治疗药物，但是在其使用过程中存在严重副作用，对患者的肝、肾功能等有较为严重的损害，而且价格昂贵。甲硝唑目前尚未获得FDA批准，但由于其价格低廉，是目前最普遍采用的治疗药物。其它使用的抗生素包括庆大霉素、亚胺培南(β-内酰胺类抗生素)、红霉素、克拉霉素和环丙沙星等。但是这些抗生素的使用已经导致了严重的抗药性问题，并且都会不同比例(15％到35％)的使已经治愈的病人复发CDAD。这些复发的病人再使用这些广谱抗生素治疗已经没有任何疗效，如果没有其他的治疗手段，将导致病人病情恶化甚至死亡。

科学家们已经普遍意识到这个问题，有针对性的开发新的治疗药物已经迫在眉睫，但是由于艰难梭菌极度厌氧，在该病原体的基因组序列于2006年被完全测定前，对它的研究一度陷于困境。因此目前对艰难梭菌的研究大多数都集中在毒素A和毒素B的研究领域中。开发药物的方向也主要集中于如何降低甚至中和毒素A和毒素B的毒性。例如美国健赞公司(Genzyme Corp)开发的tolevamer，已经进入三期临床。但是这类药物只能用于减轻患者的症状，无法抑制或者杀死病原体，因此只能作为一种辅助的治疗手段。要彻底根治CDAD，必须有针对性的开发新药物，提出新的治疗思路。

基因组序列的完全测定极大的方便了人们对它的研究，序列分析表明在艰难梭菌中含有一种目前只在厌氧细菌中存在的乙酰辅酶A合成酶(ACS)。乙酰辅酶A是物质和能量代谢的重要物质，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。ACS催化乙酰辅酶A的合成，是艰难梭菌乙酰辅酶A合成通路中的关键金属酶。如果该酶的活性被抑制，将导致病原体艰难梭菌不能正常进行能源和物质代谢，进而导致其生长被抑制甚至死亡。因此，对ACS的活性抑制研究，可能找到杀死和抑制艰难梭菌的生长和疾病防治的潜在药物，该酶可以作为治疗CDAD的一种潜在药物靶标。

发明内容

本发明的目的是提供一种病原体艰难梭菌乙酰辅酶A合成酶(ACS_cd)的活性抑制剂，作为抑制艰难梭菌的生长和疾病防治的用药物。

乙酰辅酶A合成酶的活性中心由Fe₄S₄和双核镍两部分组成。研究发现该酶中的镍在螯合剂的作用下易被脱去，从而导致ACS的活性降低甚至被完全抑制。常用的螯合剂有1，10-邻菲咯啉(I)、2，2-联吡啶(II)和8-羟基喹啉(III)。其中，8-羟基喹啉是已在二期临床上应用的药物，用于治疗阿尔兹海默症。这种螯合剂的结构式如下：

本发明的螯合剂作为ACS抑制剂的验证步骤如下：

本发明以下操作均在厌氧手套箱中完成。首先配制一定浓度的柠檬酸钛溶液，并用铁氰化钾标定其精确浓度。然后分别配制一定体积的10μM的甲基钴铁硫蛋白(CoFeSP)和1mM的柠檬酸钛混合溶液以及20μM的ACS_cd和1mM的柠檬酸钛混合溶液，结合半小时以上。使用截流分光光谱仪(Stopped-flow)检测ACS_cd的甲基转移活性，作为空白对照。

用无水乙醇分别配好1M浓度的螯合剂1，10-邻菲咯啉、2，2-联吡啶和8-羟基喹啉。取出一定体积无水乙醇以及同等体积的上述螯合剂分别加入到10μM的甲基钴铁硫蛋白(CoFeSP)和1mM的柠檬酸钛混合溶液中，结合一小时以上。使用截流分光光谱仪(Stopped-flow)检测ACS_cd的甲基转移活性，发现在1mM的浓度下，1，10-邻菲咯啉、2，2-联吡啶和8-羟基喹啉均能有效抑制ACS_cd的甲基转移活性，抑制率均接近100％，而同等体积的无水乙醇没有抑制作用。