[发明专利]山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，是一种利用微生物黑曲霉降低山葡萄酒中酒石酸含量的方法，属于食品加工领域。

背景技术：

山葡萄产于我国东北地区，与欧亚种酿酒葡萄相比存在较大差异，其含糖量很低，一般为130～150g/L，而含酸量却很高，其成熟果实的可滴定酸含量就在15～25g/L(以酒石酸计)之间。但是正常干型葡萄酒要求酸度在8g/L左右。而目前针对山葡萄酒的降酸问题还未提出有效的解决方法，因此，山葡萄酒的降酸方法有待进一步提高。

传统的降酒石酸方法是通过物理方法和化学方法处理达到降酸目的，但传统的方法需要借助冷冻设备及需要消耗大量的酒石酸钾，能源消耗和生产成本较大，并且口感不协调，降酸幅度达不到理想标准。虽然随着现代发酵工程技术和基因工程技术的发展，目前研究出了针对苹果酸的微生物降酸方法，而利用生物技术降低酒石酸在目前却没有报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，其采用生物技术筛选能降解酒石酸的微生物——黑曲霉菌，并利用该微生物降低山葡萄酒中的酒石酸含量，确定最佳的降酸参数，以解决葡萄酒中酒石酸的生物降解问题，从而达到降酸的目的，更好地控制并且容易操作，能更好地改善山葡萄酒的品质。

本发明的技术方案是这样实现的：一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，其特征在于：降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌为黑曲霉，具体的筛选方法如下：采集葡萄园土壤和生产酒石酸工厂附近的土壤的土样2g定量加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠(直径为3～5mm)，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的酒石酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，160r/min，摇床振荡培养，以72h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时酒石酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对酒石酸具有较好降酸效果的菌种黑曲霉；

将筛选得到的降酸菌——黑曲霉用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YEPD斜面培养基上于28℃培养72h后4℃保存。

降酸应用过程如下：

将山葡萄原料进行破碎后加入0.05％的果胶酶和100mg/L的SO₂，浸汁12小时后用汁渣分离机进行分离压榨出汁，澄清后进行降酸发酵，在30～35℃条件下接入降酒石酸有效菌——黑曲霉后再对葡萄汁进行澄清处理，酒精发酵是在20～25℃条件下接入酿酒酵母菌，酒精发酵结束后再进行澄清、分离，最后进入陈酿工序。

菌种鉴定：通过对筛选后的菌落形态、个体显微形态和分子生物进行鉴定，如图1所示，对所筛选出的具有较高降酸效果的菌株F1进行菌落形态观察、显微形态观察、生理生化试验鉴定以及分子生物学鉴定试验。最终通过鉴定试验确定筛选所得到的具有降酒石酸能力的菌株(命名为F1)属于曲霉属[Aspergillus Micheli ex Fr.]中的黑曲霉组[A.niger]。

不同因素对菌株F1降解酒石酸情况的影响：考虑的因素主要有接种量、温度、酒石酸浓度、通气量和菌龄；其中温度和接种量对降酸率的影响较为明显。

产品标准：菌株耐酒精度4％以上；菌株耐SO2浓度为400mg/L；酒石酸降解率50％以上，可适应山葡萄酒的降酸要求。

检测方法：酸度检测采用氢氧化钠滴定法(以酒石酸计)。

本发明的积极效果是采用微生物——黑曲霉降解葡萄酒中的酒石酸，是在35℃温度下静止培养3d后，降酸率能达到70％以上，该菌株具有较高的耐SO₂能力，对酒精的耐受性能达到4％以上，该黑曲霉采用巴氏杀菌的方式在65℃、30min或85℃、5min即可达到杀菌的目的，并且通过毒性鉴定试验确定该黑曲霉菌株无任何毒副作用，可以运用到葡萄酒的生产工艺中；与以往的物理降酸方法和化学降酸方法相比，它不需要采用任何特殊设备及原料，成本低，降酸操作过程容易控制，也不会向葡萄酒中引入其他金属离子，且降酸率较高。试验得出将菌龄为4d的菌种以4％的接种量(孢子液浓度为8×10⁶个/ml)接入到以酒石酸为唯一碳源的培养液中，在35℃、160r/min的条件下恒温振荡培养4d后，其降酸率能达到89％。

附图说明：

图1为本发明筛选得到的10株菌株对酒石酸的降解率的比较图表；