[发明专利]用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于动物卫生检验技术领域，特别是一种快速检测猪伪狂犬病毒gE基因的新 型方法，通过观察反应管浊度和颜色变化，或紫外灯下观察琼脂糖凝胶电泳图像来判断 扩增情况，来判断结果。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又名奇痒症、奥叶基氏病，病原为疱疹病毒科的伪狂 犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)。临床上多以发热和神经症状为特征。至2007 年世界上有44个国家和地区有本病的报道，该病已成为危害全球养猪业最严重的疫病 之一。种猪感染伪狂犬病毒后引起不育；妊娠母猪发生流产、产死胎和木乃伊胎；伪狂 犬病病毒先天感染或早期感染引起哺乳仔猪的神经症状和高死亡率；对于育肥猪，伪狂 犬病毒是呼吸系统疫病综合征(PRDC)的重要病原，引起生长育肥猪的呼吸系统症状和 生长迟缓；对于种猪场来说，伪狂犬病呈阳性对于种猪的销售和品牌效应造成不利影响； 而对于出口企业，猪场伪狂犬病呈阳性面临着经济和贸易的双重损失。

近年来，我国养猪业朝着集约化、规模化方向迅速发展，饲养的密度越来越大而且 种猪交流越来越频繁，这为该病的发生、传播与蔓延创造了条件。刘有昌等于2006年 -2007年对来自天津、河北、山东等省市猪场的1502份血清样品的检测结果，最高感 染率为100％，平均感染率为49％。据不完全统计，我国每年因猪伪狂犬病毒等疾病引起 的猪呼吸道疾病综合征造成的经济损失高达数十亿人民币。世界猪伪狂犬病防制经验表 明，敏感、快速、准确的检测技术则是猪伪狂犬病防制中的关键环节。由于猪伪狂犬病 与其它许多引起猪繁殖障碍综合征的疾病存在非常类似的临床症状，加上各猪场间的临 床症状差异极大，尤其是有细菌性或病毒性的继发感染或混合感染，更增加了临床诊断 工作的难度，因此仅根据临床症状及流行病学特点很难作出诊断。目前国内外所报道的 实验室诊断方法很多，分为血清学和病原学诊断方法。

(一)血清学方法：

血清学方法包括中和法、乳胶凝集等，其中最为著名的是gE-ELISA。该方法也是 我国目前应用较多的确定野毒感染的血清学诊断方法，但是与其他的血清学方法一样， 该方法同样无法排除母源抗体干扰，因为对于10周龄以内的仔猪很难判断gE抗体是来 自母源抗体，还是由于感染。而且血清学的方法不能检测到伪狂犬病毒的潜伏感染。伪 狂犬病毒在初次感染康复后可以潜伏在神经结中，这时抗体检测为阴性，但是当机体受 到内外因素刺激时，病毒被活化并引起疾病的发生和传播。

(二)病原学方法：

1.细胞培养法

在病原学诊断方法中最经典、准确的方法是从发病猪体采取病料组织，用细胞来进 行病毒分离，但此方法耗时长(7-10天)，很难满足临床诊断所要求的时效性，主要应 用于科学研究。

2.基因诊断技术

各国学者对该病毒的分子生物学特性、实验室诊断基因进行了大量的研究，目前伪 狂犬病毒已有75％的基因定位，一些重要的糖蛋白的结构和功能都已清楚。这些都推 进着伪狂犬病的基因诊断技术的发展。

人们已经建成了多种方法，例如核酸探针杂交技术、PCR技术，荧光定量PCR技术 等等，伴随着基因缺失疫苗在伪狂犬病防治上的应用，与其相应的鉴别PCR应运而生， 陈陆一等根据已发表的伪狂犬病病毒gB、gE基因的序列，设计并合成了两对引物，分别 建立了一种通用和一种鉴别PCR诊断方法，可以用于鉴别疫苗株与野毒株感染。万超等 以伪狂犬病毒(PRV)保守的gE基因序列为参考，设计、优化出一对特异的PCR引物和一 条TaqMan荧光探针，建立一种快速定量检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。

目前对于PCR技术已经有了相当多的研究，但是在应用过程中人们发现它存在很多 不足之处：(1)靶基因易被污染。(2)常引起非特异性扩增。(3)反应所需taq DNA酶经 常受到组织、血液和IgG等成分的影响，而降低活性，从而抑制扩增反应。(4)需要比 较昂贵的PCR仪。(5)扩增反应时间较长，一般需要几个小时，不利于在基层实验室推 广应用等等。鉴于目前诊断方法的不足，建立更为简便、快速、特异、适于现地应用的 诊断方法，对猪伪狂犬病的及时监测、鉴别自然感染猪只及实施控制和扑灭计划均具有 重要意义。

随着科学技术的迅猛发展，一些先进的分子生物学技术和免疫学技术已经在实验室 研究中得到普及应用，为兽医诊断技术的研究提供了新的手段。