[发明专利]一种小鼠胰腺干/祖细胞的离体筛选扩增技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型高效的离体筛选扩增小鼠胰腺干/祖细胞技术，具体涉及到采用胶原 酶部分消化后两次转接富集胰腺干/祖细胞，挑取单细胞集落纯化，及进一步扩增具有强增殖 和分化能力的成体小鼠胰腺干/祖细胞的方法。

背景技术

糖尿病是一种由于胰岛β细胞缺乏或功能缺陷引起的，以血糖增高为特征的代谢疾病。近 年来，随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率和患病率逐年 提高，糖尿病已成为当今医学三大难症之一。糖尿病不仅影响患者的生活质量，也给病人带 来沉重的心理负担，而且糖尿病并发症对患者的健康和生命构成威胁。最近的临床试验表明， 胰岛移植结合免疫抑制治疗可以彻底治愈I型糖尿病，但供体的严重缺乏制约了这一治疗途 径的广泛应用。

胰腺干/祖细胞是一类具有高增殖能力并可以定向分化为胰岛β细胞的多能细胞，利用胰 腺干/祖细胞离体扩增和分化为β细胞可以有效解决移植供体来源不足问题，因而成为细胞替 代疗法治疗糖尿病的基础。但成体胰腺干/祖细胞做为移植供体细胞的来源目前主要存在以下 障碍：(1)成体胰腺组织中干/祖细胞比率极低，缺少公认的标志性分子，难于通过流式细胞 术筛选和富集；(2)利用离体培养方法筛选胰腺干/祖细胞过程中，多种细胞混杂，尤其是成 纤维细胞生长旺盛，从而导致上皮来源的胰腺干/祖细胞难于被纯化和大量扩增。因此，首先 富集胰腺干/祖细胞，在培养过程中排除成纤维细胞污染，进一步纯化胰腺干/祖细胞并大量扩 增是离体条件下获得充足胰腺干/祖细胞的关键环节。

发明内容

本发明利用模式动物小鼠建立了一种新型高效的胰腺干/祖细胞筛选方法，通过胶原酶部 分消化富集获得胰腺干/祖细胞，根据不同类型细胞贴壁速度不等的原理，采用了两次转接、 反复贴壁的方法有效筛除了成纤维细胞，并进一步挑取具有强增殖能力的单细胞集落，最终 筛选获得一群均质的，具有典型干/祖细胞特性的胰腺上皮细胞。

具体步骤如下：

一、小鼠胰腺组织的取材

1.取1～2只健康成年小鼠，颈椎脱臼法处死，用70％～75％乙醇浸泡5分钟，超净台内打 开小鼠腹腔，沿脾脏下方至十二指肠回弯处，用剪刀小心剪下淡粉色的胰腺组织。

2.在体视显微镜下剔除胰腺上的脂肪、血管、系膜及淋巴结，PBS缓冲液清洗两遍。

3.将胰腺移入干净的3.5cm培养皿中，用弯头剪剪成约1mm³大小的组织块，加入适量PBS 缓冲液清洗一次，去除组织及细胞碎片。

二、胰腺单细胞的分离

1.向盛有胰腺组织的培养皿加入1～2mL 0.8mg/mL胶原酶IV消化液以及20ul 0.1mg/mL的 DNA酶I，置于37℃培养箱消化20min。

2.加入1.5～2mL冷PBS缓冲液，用带有剪去尖部枪头的移液器反复吹打组织，使从组织 块上消化下来的单细胞尽可能解离释放出来，自然沉降约10～15秒，收集含单细胞的上清于 15mL离心管中，重复清洗组织块操作4～5次后弃掉未消化的组织块。

3.将收集到的上清液置于水平离心机中，800～900rpm/min离心5min。弃去上清液、上层 的细胞碎片、DNA絮状缠绕物及中间层血细胞，保留最下层乳白色的胰腺实质细胞层。

三、胰腺干/祖细胞的筛选与纯化

1.用含10％胎牛血清(FBS)的D/F12培养基重悬细胞沉淀，将胰腺单细胞悬液接种于1 个6cm培养皿中，37℃5％CO₂培养箱中培养40min。

2.将未贴壁的细胞连同培养基一起转接到2个新6cm培养皿中，培养过夜，原培养皿中 已贴壁细胞主要为成纤维细胞，弃掉此培养皿。

3.将第一次转接后过夜培养的皿中仍未贴壁细胞及其培养基一起转接到另外2个新6cm 培养皿中，进行再过夜培养，第一次转接后过夜培养贴壁的细胞换成扩增培养基继续培养。

4.24h后，弃去第二次转接后再过夜培养的皿中未贴壁的细胞及其培养基，贴壁细胞换 成扩增培养基继续培养，每3天更换1/2原培养基。

5.扩增培养基为添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉素-100μg链霉素、2％FBS、2％ B27、20ng/mL表皮生长因子、10μg/mL胰岛素、50μmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM/F12培 养基。