[发明专利]一种集胞藻PCC6803表达外源基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种蓝细菌集胞藻PCC6803高效表达外源基因的方法。

背景技术

蓝细菌，又称蓝藻，是一种可以进行光合作用的原核微生物，可以直接利用太阳能、二氧化碳和水进行生长，具有生长速度快、光合作用效率高等优点。因此，蓝细菌作为一种基因工程的模式宿主微生物，在生物能源和生物制药领域具有广泛的应用前景。

蓝细菌具有特殊的遗传操作背景，国内外许多科研团队对蓝细菌的外源基因表达进行了研究，但是和传统的基因工程宿主大肠杆菌相比，蓝细菌对外源基因的表达效率仍然非常低。如何使目的基因在蓝藻中得到高效表达仍然是一个难题。因此，开发在蓝细菌中高效表达外源基因的平台技术非常重要。

蓝细菌中的基因表达平台是指一种表达载体，按照载体在蓝细菌体内的存在形式，又分为穿梭质粒载体和基因组整合质粒载体两种。两种类型的表达载体都可以主要借助于自然转化(主要是单细胞蓝藻)或者接合转移的方法将目的基因导入蓝细菌体内。穿梭质粒载体可以通过接合转移导入蓝细菌，在细胞质中自主复制。基因组整合载体可以将目的基因乃至整个操纵子通过同源整合的方式整合到蓝藻基因组中，它的优点是表达稳定，可以克服自主复制质粒不稳定的缺点。

启动子的选择对于基因表达至关重要。rbc(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase gene)启动子是蓝细菌体内的强启动子，其产物1，5-二磷酸核酮糖缩化酶/氧化酶(RuBisCO)是蓝细菌体内主要的可溶性蛋白，在光合作用中起重要作用。rbc启动子具备在蓝细菌体内高效表达基因的能力，被成功应用在多种蓝细菌菌株中表达基因，其中包括聚球藻6301(Synechococcus PCC 6301)，鱼腥藻7120(Anabaena sp.strain PCC7120)，聚球藻7002(Synechococcus PCC 7002)，聚球藻7942(Synechococcussp.strain PCC 7942)等。

集胞藻6803(Synechocystis PCC6803)是蓝细菌中的模式菌株，其基因组序列已经于1996年被测定，并且遗传操作方法相对成熟，适合作为一株模式藻株进行转基因研究。集胞藻6803是单细胞蓝藻，可以利用自然转化接受外源DNA，也可通过接合转移的方法进行遗传操作。在集胞藻6803(Synechocystis PCC6803)中，Doron Amichay和Ruth Levitz等的研究中提到rbc启动子并且推断出了集胞藻6803中rbc启动子的具体信息，rbc操纵子中包括启动子元件和rbcL、rbcX和rbcS基因，整个操纵子在rbcL基因上游250bp处开始，并且推断在rbcS终止密码子下游有一段40bp反向互补序列为终止序列，Amichay等通过测序和分析认为在rbcL上游-15～-10区有类似SD序列，并且在翻译起始密码子上游60bp处发现两处类似-10区和-35区的序列[参见(Construction of a Synechocystis PCC6803mutant suitable for thestudy of variant hexadecameric ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenaseenzymes，Doron Amichay，Ruth Levitz and Michael Gurevitz，Plant MolecularBiology 23：465-476，1993.)]。