[发明专利]多生物素信号放大方法

说明书

技术领域

本发明涉及生命物质的检测，尤其涉及对生命特征物质的检测。

背景技术

生命特征物质包括DNA和RNA两大类。

以DNA物质为例，乙型肝炎是一种由乙肝病毒引起的肝脏感染，对机体潜在威胁较大，是世界上一种主要的健康问题和最严重的病毒性肝炎类型。乙肝在中国和其它亚洲地区流行，估计有20亿人受到乙肝病毒感染。尽管流行地区采取了计划疫苗成功地使乙肝表面抗原(HBsAg，慢性感染的血清学标志)流行程度下降，仍有3.5亿的病毒携带者，其中25％将会发展为肝病、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)，每年估计有60万人死于乙肝引发的急慢性疾病。中国每年HBV直接的医疗开支大约在260亿人民币以上。

血液中的标志物可用于乙肝感染的诊断和急慢性感染的鉴别诊断，这些标志物包括乙肝病毒的抗原和抗体。乙肝病毒有三种常用的抗原---表面抗原(HBsAg)，现行的HBV感染诊断基于对表面抗原的免疫学检测，核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)及其相应的抗体。尽管这些检测可以用于携带者初筛，但不能用于血清中感染性病毒的检测。

HBV-DNA是病毒复制的最直接标志。HBV是小DNA病毒，核外壳含有一条3.2Kb的部分双链的基因组，其复制通过RNA介导。测定血清中HBV-DNA是鉴别病毒是否复制的重要工具，检测到血标本中的HBV DNA标志者病毒活跃复制。在急性肝炎，HBV-DNA感染后不久即出现，清除感染后则消失。在慢性乙肝，HBV DNA水平常常持续增高多年，免疫系统控制病毒时则下降。对于慢性乙肝，一些HBsAg阳性、抗HBe阳性而HBV活跃复制的患者，应用PCR检测特别有用。

有5-10％进行肝移植的病人患上HBV相关的慢性和暴发性肝病。HBV再感染可能是由于来源于循环血、肝外部位或二者的HBV病毒颗粒移植的直接再感染。没有预防性检测，HBV再感染的风险几乎是80％。再发性感染可导致移植物衰竭、再移植或死亡。因此肝移植随访HBV感染，对长期生存至关重要。这就需要更加敏感的HBV-DNA检测。

抗病毒治疗是控制和防治慢性乙肝疾病进展的唯一选择。已经证明核苷类似物在控制疾病进程是有效的，不过耐药性的发生限制了远期效果。拉米夫定是第一个批准用于该病治疗的核苷类似物。拉米夫定耐药性每年的发生率是14-24％，4-5年的发生率是70％。由于耐药毒株的发生，完整地监测病人显得越来越重要，多种突变主要发生在HBV聚合酶反转录酶区的活性位点，YMDD。有二个主要的突变与拉米夫定耐药性有关：rtM204V和rtM204I，其它的突变有rtL80V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rt181T、rtT184S、rtM240V/I/S和rtQ215S。

目前HBV耐药性检测基于PCR方法，不过这有二个潜在的问题，首先由于DNA污染可能导致假阳性，再者用PCR同时检测多种突变是非常有限的。

PCR是一种直接高敏检测病毒基因组的方法，但由于污染所致假阳性的风险以及发展定量检测方法上的困难可能阻止其应用。此外，由于次优反应条件和DNA的不完全变性可导致假阴性，标本收集和/或处理方面的错误也可能引起问题。

以RNA物质为例，丙型肝炎病毒(HCV)是肝脏相关发病和死亡的另一种主要原因，全球有1.7亿HCV引起的慢性感染，占世界人口的3％。其长期严重的临床疾病风险是肝硬化和肝癌。中国每年有30万人死于急慢性乙肝和丙肝，与HBV相同，HCV感染可引起急慢性丙肝、肝硬化和原发性的肝细胞癌(HCC)。研究显示与HBV相比，HCV与HCC关系更密切，80％HCC由HCV引起，由HBV引起则是15％。HCV感染与HBV明显不同的是HCV感染与脂肪肝、肝脏介导的糖尿病、B细胞淋巴瘤相关。中国每年HCV直接的医疗开支大约在117亿到216亿人民币。

HCV是单链的RNA病毒，有快速自发的突变，其频率估计是每年每个核苷酸是1022次突变，致使世界上许多分离的病毒序列相异较大，这使得疫苗开发很困难，因此有效诊断HCV对防止丙肝的传播至关重要，长期来看这将节省医疗资源，降低HCV的医疗开支。基于一定的基因差异及相似性，HCV可以分成6个主要的基因型，1、2、3、4、5和6，其分布在不同的国家，2型是中国最常见的类型，欧洲和美国是1型。基因型信息对HCV治疗是非常重要的，其可预测治疗效果，例如用聚乙二醇化干扰素加利巴韦林对2型或3型要治疗24周，1型是48周。