[发明专利]一株用于生产γ-亚麻酸的酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一株用于生产γ-亚麻酸的酵母工程菌，属于基因工程领域，本发明可用于通过酵母工程菌表达假狼紫草Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因，将底物亚油酸催化转变为高价值γ-亚麻酸。

背景技术

1917年，德国化学家在月见草(Oenothera biennis)中发现了一种其它植物体中极为少见的脂肪酸--γ-亚麻酸，后称为维生素F。目前，γ-亚麻酸作为具有生理作用的药物，已经广泛受到国内外医学界的重视，用于防治心血管疾病、糖尿病、降低胆固醇及抑制溃疡、胃出血、妇女经前综合症等，另外，γ-亚麻酸在营养学及美容、化妆品方面也有应用。γ-亚麻酸等多不饱和脂肪酸因在人类健康中具有重要作用而成为极具价值的产品，据估计全球市场需求过万吨。研究表明，γ-亚麻酸仅存在于紫草科等的少数植物中，目前主要商业来源为月见草、玻璃苣(Borago officinalis)和黑醋栗(Ribes Nigrum)，也有通过真菌的发酵提取获得。然而，现在通过植物和真菌发酵生产γ-亚麻酸成本高且在质量和产量上都不能满足日益增长的市场需求。

1993年，Reddy等人首次从一株产γ-亚麻酸的蓝细菌(Synechocystis sp.PCC6803)中克隆到Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因，并在Δ⁶-脂肪酸脱氢酶缺陷的蓝细菌(Anabaena sp.PCC7120)中获得了功能性表达，推动了Δ⁶-脂肪酸脱氢酶遗传学水平的研究。1997年，Olga V.Sayanova等首次从高等植物琉璃苣中克隆Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因，通过转基因烟草验证该基因活性。2003年，Heather M.Whitney根据保守结构域细胞色素b5结合结构域设计简并引物从毛茛科银莲花(Anemone leveillei)中克隆获得两个脱氢酶基因AL1、AL2，其中AL1基因经酵母与拟南芥表达验证具有Δ⁶-脂肪酸脱氢酶活性，毛茛科银莲花Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因是非紫草科高等植物中克隆获得的第一个Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因。

目前Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因在真菌细胞中的表达最常用的宿主是酿酒酵母，酿酒酵母本身只能合成油酸，只有外源性添加亚油酸，转基因酵母细胞才能合成γ-亚麻酸，我国南开大学微生物学系将高山被孢霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶转到毕赤酵母中获得表达，然而同样的低油含量以及复杂组分使得进一步应用难以推广。通过微生物的基因工程生产γ-亚麻酸仍有待于深入研究。通过利用基因工程方法生产γ-亚麻酸在理论和方法上已经初步建立，为以后大规模生产奠定基础。

发明内容

本发明涉及一株用于生产γ-亚麻酸的酵母工程菌，属于基因工程领域，本发明将紫草中克隆获得的Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因通过酶切连接构建到PYES2酵母表达载体，将该表达载体用LiAc法转化酵母感受态细胞，通过酵母表达系统启动Δ⁶脂肪酸脱氢酶基因的转录表达。本发明可用于将亚油酸转变合成高价值γ-亚麻酸。

本发明可以通过以下技术方案实现：

提取假狼紫草基因组DNA，用特异性引物PCR的方法扩增获得Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因，将该基因用EcoRI 和XbaI作为酶切位点构建到PYES2酵母表达载体，制备酵母感受态细胞，用LiAc法转化酵母感受态细胞，利用该载体系统可在酵母工程菌中表达Δ⁶-脂肪酸脱氢酶，从而将亚油酸转变为高价值γ-亚麻酸。

附图说明

图1为用于生产γ-亚麻酸的酵母表达载体的载体图，图中指出的为Δ⁶脂肪酸脱氢酶基因的位置，通过T7启动子启动Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的表达。

图2a为γ-亚麻酸标准品气相色谱图；图2b为酵母转化空载体脂肪酸分析气相色谱图；图2c为酵母转化Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因脂肪酸气相色谱分析图。

具体实施方式

紫草基因组DNA的提取(改进的CTAB法)

(1)紫草叶片100mg，加入0.1gPVP及少许石英砂。加液氮研磨成粉末状，置于1.5ml离心管内；

(2)向每个离心管内加入600μL预热的CTAB提取缓冲液，并轻轻混匀，65℃水浴30min，其间不时摇动；