[发明专利]一种酿酒酵母菌株及其选育方法以及该菌在酒精生产上的应用

权利要求书

1.一种能快速生长高温浓醪发酵生产酒精的酿酒酵母菌，其分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，菌株号为Y09tj，已于2009年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.3476。

2.酿酒酵母菌CGMCC NO.3476的选育方法，其特征是从常见的农家自酿甜酒中分离并经紫外诱变筛选得到，

(1)培养基

YPD液体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，自来水定容至1000ml；

YPD固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，琼脂15g，自来水定容至1000ml；

种子培养基：同前述YPD液体培养基；

上述培养基经高温121℃灭菌20min；

发酵培养基：30％-40％的淀粉，加自来水定容至100ml，加入量为11u/g淀粉的耐高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅95℃液化2h，冷却至61℃，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在61℃水浴锅糖化45min，再添加尿素0.1g；

(2)出发菌株分离筛选

菌种初筛：取5g甜酒样品加入装有100ml无菌生理盐水的小三角瓶中，置37℃摇床振荡培养2h，静置5min，取上清液做浓度梯度稀释至10^-6倍，取200μl稀释液涂布于YPD平板，37℃倒置培养2d，挑取较大的酵母单菌落转接于10ml含10％葡萄糖的YPD液体培养基，置37℃，160r/min摇床培养，观察产泡沫的速度和量，闻发酵液中酒精浓度，初步筛选产酒精快而多的菌株，经YPD平板分离划线法得到纯种，取一环活化好的菌种接于5ml液体YPD培养基，37℃，160r/min摇床培养16h得初筛菌种种子液；

菌种复筛：30g的淀粉按1∶2.2(w/v)的料水比调好淀粉浆液，加入量为11u/g淀粉的耐高温α-淀粉酶，在水浴锅95℃液化2h，冷却至61℃，加入量为57u/g淀粉的糖化酶，在61℃水浴锅糖化45min，淀粉糊液冷却至37℃，加入终浓度为0.1％的尿素，分别接入初筛菌种种子液，接种量为5％，置37℃，160r/min摇床发酵3d，定时取样测酒度和残糖，选出生长发酵速度快，产酒率高，残总糖和残还原糖低的菌株，以此菌株作为出发菌株；

(3)紫外线诱变育种

酵母菌原生质体制备：从活化好的菌种斜面上分别取一环接种于100ml液体培养基上，于30℃，200r/min摇床培养12～16h，收集对数生长期细胞，各取5ml加入离心管中3500r/min，离心5min，用0.1mol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲溶液(PB)洗2次，30℃静置10min，离心弃去上清液，加入含有纤维素酶和蜗牛酶的PB破壁溶液，于30℃水浴处理处理30min，2000r/min，离心10min，用含0.1mol/L磷酸缓冲液、0.7mol/L KCl、pH6.0的高渗PB缓冲液洗涤2次，离心收集原生质体；

酵母菌原生质体诱变：取10ml原生质体液置于带转子的9cm的平皿中，在15W紫外灯下距30cm磁力搅拌照射15-20s后，取0.2ml涂在含5％NaCl的YPD固体培养基高渗平板，30℃恒温避光培养3d；

平板初筛：将紫外照射后的菌液涂布YPD平板，分别放置在37℃、40℃进行培养，选出生长快且菌落大的耐高温菌株，将选出的耐高温菌株的以同样的方法制备原生质体，以同样的方法经紫外线照射，菌液涂布在含8％～15％酒精浓度的YPD平板，于37℃培养，选出生长快且菌落大的耐高温、耐高酒精菌株，再利用含0.1％TTC的YPD固体培养基平板筛选出产酒精能力强的突变菌株；

发酵复筛：利用平板初筛获得的菌株用发酵培养基进行发酵筛选，用显微镜观察菌体的活菌数和出芽率，筛选出产酒性能最优的酵母菌。

3.利用酿酒酵母菌CGMCC NO.3476发酵淀粉生产酒精的应用。

4.利用酿酒酵母菌CGMCC NO.3476高温快速浓醪发酵淀粉生产燃料酒精的方法，步骤如下：

1)种子液准备

接种酿酒酵母菌CGMCC NO.3476于YPD液体培养基中，37℃摇床培养过夜，使OD₆₀₀约为10左右，得种子液；

2)浓醪液准备

基于容器的容积，称取重量体积比30％～40％的淀粉置于容器中，加水搅拌均匀，按20u/g淀粉加入液化酶，水浴加热使液化温度为85-90℃，液化时间1h，使DE值为15％-20％，得浓醪液；

3)接种发酵

浓醪液降温至37℃，按100u/g淀粉加入糖化酶，添加0.1％(m/v)的尿素，以5％接种量接入种子液，置于37℃摇床进行同步糖化发酵，转速100r/m，发酵时间46h，即可得酒精。