[发明专利]拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽及其构建方法与用途

说明书

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种能诱导鱼体产生抗拟态 弧菌感染的保护性免疫反应的OmpU抗原B细胞多表位串联肽及其构建 方法与用途。

背景技术

拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种人和水产动物共患病病原菌，不 仅可引起水产动物严重的腹水病，而且可通过水体和水产品感染人类， 引起人类腹泻和食物中毒。据不完全统计，近年来鱼类腹水病的平均病 死率达30％-40％，且有上升趋势，已成为水产养殖业持续发展的瓶颈。 因此，建立该病快速诊断方法和研制新型高效的拟态弧菌疫苗显得十分 必要，而寻找出理想的拟态弧菌保护性抗原或抗原表位则是解决问题的 关键。

抗原表位是抗原分子中诱导特异性免疫应答最基本的结构和功能 单位。以多个表位为基础而设计的多表位疫苗是一种新型、高效分子疫 苗，除具有安全、无毒、特异性强和易于大规模生产等优点外，可将同 种病原体的多个表位或不同病原体的多种表位连在同一载体上，以有效 应付微生物变异和预防多种病原体的混合感染，也可非常针对性地开发 疫苗，排除非相关免疫应答的产生，从而大大地降低副作用，还可以连 接内在佐剂，大大提高免疫效果。制备多表位疫苗的关键技术是如何准 确筛选和鉴定抗原表位。传统的表位筛选鉴定方法包括化学法、合成重 叠肽法、酶解法及噬菌体展示技术等。这些方法虽然准确率较高，但 是存在耗时费力、成本较高的缺点。近些年来，随着计算机辅助分子设 计技术的发展和基因组测序工作的不断展开，国内外建立了大量蛋白质 表位数据库，开发了大量表位分析软件，但预测的准确率在70％左右， 仍需通过生物学实验加以验证。

同大多数病原菌一样，拟态弧菌的致病性是由黏附素、毒素和毒性 酶类等多种毒力因子共同作用的结果，其中外膜蛋白U(Outer membrane protein U，OmpU)是一种高度保守的黏附素蛋白。研究发现OmpU不 仅可介导细菌黏附细胞，启动感染外，还能诱导机体产生抗体，阻断细 菌黏附，在病原菌入侵最初阶段发挥免疫保护效应，是一种良好的疫苗 候选抗原和诊断抗原。研究拟态弧菌OmpU抗原B细胞抗原表位对疾病 的诊断和设计多表位疫苗具有重要意义。

发明内容

本发明首先提供了一种能诱导鱼体产生保护性免疫反应的OmpU蛋 白B细胞多表位串联肽，所述的多表位串联肽的氨基酸序列如 SEQIDNO：10所示。

本发明同时提供了OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的构建方法，其 包括以下步骤：

(1)设计编码OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的多表位串联基因， 其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，也即SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、 SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7 所示核苷酸序列，并以SEQIDNO：8所示的核苷酸序列相连接，在所述 的多表位串联基因序列两端分别添加EcoR I酶切位点和Pst I酶切位点 以及终止密码子TAA，全基因合成；

(2)构建重组表达OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的重组表达菌， 并进行表达、鉴定和纯化重组蛋白。

本发明还提供了上述多表位串联肽在拟态弧菌新型表位肽疫苗研 制中的应用，具体包括如下方面：

(1)多表位串联肽疫苗的配制

(2)多表位肽疫苗的免疫及特异性抗体检测

(3)多表位肽疫苗的免疫保护性检测

(4)多表位肽疫苗的安全性检测

本发明提供的是通过基因工程技术生产的拟态弧菌OmpU蛋白B细 胞多表位串联肽，经免疫印迹分析、特异性抗体检测和免疫动物保护性 实验验证，表明其能激发高效而特异的抗拟态弧菌感染的保护性体液免 疫应答。

本发明快速、准确、经济地获得了具有免疫保护性的拟态弧菌OmpU 蛋白B细胞多表位串联肽，获得的此B细胞多表位串联肽可用于水产动 物腹水病的免疫诊断和免疫防治。

附图说明

图1拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽基因的PCR扩增

图2重组表达质粒pAML-c4x-OmpUepis的双酶切鉴定

图3拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽基因的测序图

图4重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE鉴定

图5表达产物的Western-Blot鉴定