[发明专利]一种茶树CsBDP抗逆基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种茶树抗逆基因CsBDP cDNA序列的克隆及其应用，其利用基因改良技术培育新的茶叶品种，改善在各种胁迫环境中茶树的抗逆性，提高茶叶的产量和质量，属于基因工程技术领域。

背景技术

植物分子生物学的研究热点之一是植物抗逆基因的发掘与利用。这些抗逆基因的发现为通过基因工程技术实现植物的基因改良提供了丰富的材料。植物BURP结构域(BURP-domain)是由Hattori等人根据最初发现的含有此结构域的四个植物蛋白命名。目前随着研究的深入，越来越多的植物BU RP-domain类蛋白被发现，这些成员组成了较为庞大的植物BURP-domain类蛋白家族，这个蛋白家族的不同成员在植物的生长、发育及对抗胁迫环境的抗逆性功能中发挥着重要作用。

最新的研究结果显示，植物BURP-domain类蛋白家族可以划分为BNM2-like、USP-like、RD22-like、PG1β-like、BURP V、BURP VI和BURPVII 7个亚族，不同亚族的蛋白在植物的生长发育过程中发挥不同的作用。目前的研究表明，RD22-like亚族蛋白多与植物的抗胁迫反应(如干旱脱水和脱落酸诱导)有关，即该亚族蛋白编码基因为植物的抗逆基因。

茶树是重要的经济作物，茶叶生产是一些地区的主要经济来源。因此，利用现代生物学技术，特别是基因改良技术培育新的茶叶品种有重大意义。茶树的生长对于环境的要求很高，生长环境好坏直接决定了茶树的生长状况以及茶叶品质的高低。各种胁迫环境常常会引起茶叶产量和质量下降，因此研究茶树的抗逆性，尤其是茶树自身抗逆基因，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个问题是提供一个茶树BURP-domain类蛋白抗逆基因(CsBDP)，其具有如序列表SEQ ID NO：1所示的基因序列。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种茶树CsBDP抗逆基因，通过设计一对简并引物RD01和RD02进行PCR扩增，其主要特点是：

简并引物RD01，其序列为：5-GGA GAG GAR AAR TAT TGT GC-3；

简并引物RD02，其序列为：5-TGT GGC ANA CNG CAN CTG CT-3；

PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终止延伸10min。

扩增反应后得到序列长度为304bp的CsBDP基因的保守序列片段。

对CsBDP基因进行5′RACE和3′RACE操作。根据已经获得的CsBDP保守片段设计两个基因特异性引物，其主要特点是：

基因特性引物5′-GSP，其序列为：5′-GCA TCG CTT GCC ATC TTCTTC ACT CCT T-3′；

基因特性引物3′-GSP，其序列为：5′-AGC CGT AGT GTG CCA TAAGCA AAA C-3′。

5′RACE PCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终止延伸10min。3′RACEPCR反应循环参数为：94℃预变性2min；95℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终止延伸10min。

通过5′RACE和3′RACE，分别获得了长度为918bp和659bp的CsBDP基因的5′端和3′端序列(图4)。将三段基因片段拼接后获得了CsBDP的全长cDNA序列，如序列表SEQ ID NO：1所示。CsBDP全长1333bp。

本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质CsBDP。其具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

通过ORFinder软件预测，CsBDP基因编码一个337个氨基酸的多肽，如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明所要解决的第三个问题是提供含有茶树CsBDP基因的重组大肠杆菌。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

首先将融合PC R所需的7个DNA片段(lacO/P1、lacO/P2、lacY1、lacY2、kan1、kan2和CsBDP)进行独立扩增。采用“两步法”融合PCR构建线性DNA打靶片段kan cassette和CsBDP-kan cassette。其特征在于：