[发明专利]一种用于绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及胚胎干细胞的生物技术，采用机械剥离和无血清分离培养技术，为转基因绵羊的生产提供坚实的技术平台。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)，是由哺乳动物着床前囊胚期内细胞团(inner cell mass，ICM)，经体外特定培养环境选择、适应后，获得的具有保持未分化状态和无限增殖能力的细胞系，其特定的生物学特性能够使其与ICM重新整合，并参与到胚胎发育的全部过程中。采用ESC克隆技术，其整合效率远远高于传统核移植技术，可在短期内生产较多的具有遗传同质性的动物，免去后裔测定，大幅度提高良种家畜的繁殖效率。同时利用ESC细胞生产转基因家畜，将会大幅度提高饲料转化率，促进动物生长，提高畜产品产量，并可在细胞水平对家畜胚胎进行性别、多胎、产肉、产毛性能的早期选择，缩短家畜育种时间。

目前，国内外在绵羊ESC的研究中，普遍采用常规分离培养体系，借助小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic Stem Cell，mESC)、人胚胎干细胞(HumanEmbryonic Stem Cell，hESC)的成功经验，将影响mESC、hESC增殖、分化的因素，如饲养层细胞、条件培养基、细胞因子、生长因子、激素、胎牛血清和血清提取物等进行有机组合，依照mESC、hESC建系标准，直接应用到绵羊ESC建系研究中，但截止目前为止，绵羊ESC研究尚未获得实质性突破，普遍存在建系效率低下等问题，且最高仅获得了第8代ESC。关于绵羊胚胎干细胞的相关研究及所获ESC代数报道检索有：①白昌明.生物工程学报.2008《不同培养体系对绵羊类胚胎干细胞分离、传代的影响》oESC最高代数P8；②Zhu，Sun etal.Zygote.2007《Ovine(Ovis aries)blastula from an in vitro productionsystem and isolation of primary embryonic stem cells》oESC最高代数P3；③Dattena，Chessa et al.Mol Reprod Dev.2006《solation，culture，andcharacterization of embryonic cell lines from vitrified sheepblastocysts》oESC最高代数P5；④Talbot，Rexroad et al.Mol Reprod Dev.1993《Alkaline phosphatase staining of pig and sheep epiblast cells inculture》oESC最高代数P0；⑤Handyside，Hooper et al.Development Genesand Evolution.1987《Towards the isolation of embryonal stem cell linesfrom the sheep》oESC最高代数P1。这些都极大制约了ESC技术在绵羊遗传育种中的研究与应用。本发明以此为切入点，结合目前国内外ESC研究最新趋势，采用机械剥离和无血清分离培养方法，具有较强的科学性、实践性及应用价值。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用于绵羊胚胎干细胞(ESC)的机械剥离和无血清分离培养技术，使得绵羊ESC原代集落形成率提高至33％(14/42)，体外培养可传至16代，拓展了ESC研究领域。

本发明的目的是这样实现的：一种用于绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法，将体外培养的绵羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明带后，接种于自制的绵羊胚胎干细胞无血清培养液中；用针头固定内细胞团，置于38.6℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养，培养中每48小时半量更换培养液，pH为6.8-7.2，原代培养7-9天；之后每3-4天采用常规机械法按1∶2-1∶4传代一次，即绵羊胚胎干细胞体外培养可传至16代。

所述的绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法，无血清培养液的配制：D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3μM CHIR99021+10μL/mL N2+20μL/mL B27+10μL/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0.2mM β-Mercaptoethanol。

所述的绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法，采用32号针头将裸胚固定于培养皿底部，同时应尽量避免损伤囊胚内细胞团，以最大限度的将裸胚滋养层细胞剥离。

所述的绵羊胚胎干细胞的无血清分离培养方法，裸胚接种数量因以45-60枚/组为宜。