[发明专利]化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法

权利要求书

1.化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)以缩水甘油为底物，以无机磷酸盐为磷酸化试剂，水为溶剂，用化学法合成D，L-甘油3-磷酸或L-甘油3-磷酸；

(2)向步骤(1)的反应产物中加入过氧化氢酶和(L)-甘油磷酸氧化酶，再加入丙酮酸钠、二价金属离子、辅羧酶、磷酸三糖异构化酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶及酶保护剂；该反应体系的pH值为7.0-8.0，该反应体系在25～40℃下反应6-14h；反应过程中，色谱法检测反应进行的程度；

(3)向步骤2)的反应产物中加入磷酸酶，25～40℃反应2-8小时；

(4)将步骤(3)的反应产物减压蒸馏除去水分，残留物以少量有机溶剂提取，得到含1-脱氧-D-木酮糖的有机溶剂提取液；

(5)在含1-脱氧-D-木酮糖的有机溶剂提取液中加入硅胶，室温挥发除去溶剂，用柱层析法纯化得到1-脱氧-D-木酮糖。

2.根据权利要求1所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：步骤(1)缩水甘油是D，L-缩水甘油或L-缩水甘油；无机磷酸盐是磷酸氢二钠；缩水甘油与无机磷酸盐的浓度比为1∶1～1∶5，反应体积为1-20mL，反应温度为50～100℃，反应时间为1-5小时。

3.根据权利要求1所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：步骤(2)加入过氧化氢酶100-200units；(L)-甘油磷酸氧化酶1-20units；丙酮酸钠30-60mg、二价金属离子2-10mM、辅羧酶1-5mM、磷酸三糖异构化酶10-30units、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶200-800μg；酶保护剂1-5mM。

4.根据权利要求1所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：所述磷酸酶为酸性磷酸酶或碱性磷酸酶，用量为1-20单位。

5.根据权利要求1所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：步骤(5)柱层析法纯化的具体实现步骤是：

(5.1)用硅胶柱层析纯化DX，所用硅胶为100-300目层析硅胶，流动相为丙酮∶氯仿∶＝1∶3～5∶1(v/v)或氯仿∶甲醇∶水＝8∶1∶0.1～2∶1∶0.1(v/v/v)；硅胶薄层层析检测洗脱液，展开剂为丙酮∶氯仿＝3∶1(v/v)或氯仿、甲醇∶水＝3∶1∶0.1(v/v/v)，显色剂为5％硫酸乙醇溶液，显色方法为喷洒显色剂后95-105℃加热10-20分钟；

(5.2)合并含有DX的洗脱液，减压浓缩得到淡黄色粘稠油状物即为1-脱氧-D-木酮糖，置低温保存。

6.根据权利要求1或3所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶是微生物来源的、含有6×Histag标签的重组酶；二价金属离子是Mg²⁺、Mn²⁺或Co²⁺；酶保护剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。

7.根据权利要求1所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：所用色谱检测方法为纸色谱法，介质为普通层析滤纸，展开剂为1M乙酸铵∶99％乙醇∶EDTA-Na₂＝70∶30∶1(v/v/v)，显色剂为1-10％的硫酸乙二胺盐水溶液；显色方法为喷洒显色剂后95-105℃加热10-20分钟。

8.根据权利要求1所述的化学法-酶法制备1-脱氧-D-木酮糖的方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇或95％乙醇。