[发明专利]一种测定植物内源激素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种测定植物内源激素的方法。

技术背景

植物内源激素(Plant Endogenous Hormones)是指在植物体内合成的，通常从合成部位运往作用部位，在低浓度(1μmol/L以下)时对植物的生长发育产生显著调节作用的微量有机物质，其中赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)是植物体内重要的四种内源激素。内源激素在植物中含量极低，性质不稳定，加之细胞中其他化合物的干扰，故测定的方法必须十分灵敏和专一，传统的测定植物内源激素的方法如下：先将收集到的植物材料用液氮冷冻并保存于低于-20℃的冰箱内；然后选用合适的有机溶剂来提取材料中的激素，选用的有机溶剂既要避免提取出许多干扰的化合物，又不能破坏激素本身；最后用多种有机溶剂对提取液进行萃取即进行提取液的分离纯化，获得一定纯度的样品，利用一些大型分析仪器测定样品中的激素含量。其中提取和分离纯化的过程非常复杂繁琐，费时费力，稍有操作不当极易造成样品中待测激素的浪费，并且很难实现多种植物内源激素的同时测定。

微透析(Microdialysis，MD)是一种优良的在线取样方法，其最大的优点是：基本不干扰生物体内正常生命活动，实现活体取样。微透析的原理与普通透析技术相同，即小分子物质顺着浓度梯度通过半透膜进行扩散，只是装置精巧，可以置入小的组织空间中。将微透析探针植入生物体内，当灌流液通过探针时，生物体内相对分子质量合适的物质便会顺浓度梯度通过半透膜进入灌流液中。由于透析管中的灌流液不断流动更新，因此，跨膜浓度梯度始终存在，微透析得以持续进行。

发明内容

基于以上原理，本发明采用微透析法，在基本不干扰生物体内正常生命过程的情况下，进行活体(Invivo)、实时(In time)、在线(On line)取样检测，特别适合研究生命过程的动态变化。

本发明提供了一种测定植物内源激素的方法，采用微透析体系，在植物体上直接进行微透析收集样品，将透析液在高效液相色谱仪上进样，分离并测定出其中的激素含量；

其中，微透析体系由导引管、微透析探针、连接管、灌注介质、微量注射泵和样品收集器组成，样品的具体收集过程如下：

第一步、将导引管插入植物，再植入探针；

第二步、开动微量注射泵，调整泵的灌流速度为1μL/min；

第三步、将出液管末端放入小离心管内收集透析液。

为避免探针的脱落和损坏，植入探针后立即采用牙托水密封，其中牙托水由自凝粉与义齿基托树脂液剂混合搅拌至粘糊状而成。

本发明所采用的灌注介质储存于注射器中，为纯化水、双蒸水或超纯水，选择灌注介质的原则是水的纯度越高越好，对测定的干扰越小，灌流速度为1μL/min，探针分子截留量为30kD。

本发明的色谱条件为：流动相为甲醇∶0.2％磷酸水溶液＝60∶40，流速为0.6mL/min，柱温为30℃，检测波长为203nm(GA)、273nm(6-BA)、214nm(IAA)、263nm(ABA)。

本发明适用于植物体含水较多的部位，如植物的叶、茎和果实，尤其是植物的嫩茎。

本发明将已经成熟应用于动物的微透析技术应用于植物活体的微透析取样，以活体植物嫩茎为材料，采用高效液相色谱法(HPLC)测定了植物活体内四种内源激素的含量，初步建立了微透析方法与高效液相色谱技术相结合测定植物内源激素的方法。

传统的测定植物激素方法，样品提取过程较为繁琐，且不能做到活体检测。本发明通过微透析的方法在植物体上进行活体取样，将微透析探针植入植物体内，植物激素通过探针头部的半透膜渗透进入灌流液并被灌流液带出，收集灌流液即透析液在高效液相色谱仪上直接进样，同时测定出了细胞分裂素(6-BA)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)这四种激素。

本发明不仅避免了样品复杂的提取和分离纯化过程，还实现了植物体实时、活体、在线取样测定植物激素，更加客观真实的反映了植物体代谢过程中其内源激素的含量变化情况。

附图说明

图1、基本微透析系统示意图，其中A、注射器，注射器中贮有灌注介质；B、注射泵；C、连接管；D、样品收集；E、微透析探针。

图2、植物激素标准品色谱图，其中GA的保留时间为7.036min，6-BA的保留时间为7.626min，IAA的保留时间为9.287min，ABA的保留时间为11.003min。

图3、吴屯杨透析液中ABA色谱图，测定波长为263nm，保留时间为10.986min。