[发明专利]食品中四种致敏原麸质成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法无效

专利信息
申请号: 201010100428.5 申请日: 2010-01-21
公开(公告)号: CN101724707A 公开(公告)日: 2010-06-09
发明(设计)人: 曹际娟;郑秋月;徐君怡 申请(专利权)人: 曹际娟;郑秋月;徐君怡
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
代理公司: 大连东方专利代理有限责任公司 21212 代理人: 刘晓琴
地址: 116000 辽*** 国省代码: 辽宁;21
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摘要:
搜索关键词: 食品 中四种致敏原麸质 成分 实时 荧光 pcr 检测 引物 探针 试剂盒 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及食品致敏原成分的基因检测方法。尤其是食品致敏原麸质成分 的实时荧光PCR检测方法及其中所涉及的特异性引物、探针和相关试剂盒。

背景技术

食品成分中存在的天然致敏原成分会引起6%~8%的儿童和2%的成人的过 敏反应,严重的会危及生命。其中,麸质是大麦、小麦、燕麦、黑麦等粮食中 存在的天然成分,也是最主要、最常见的致敏原成份之一。麸质是谷物特别是 小麦中的一组蛋白质。小麦与黑麦、大麦,还有燕麦十分相近。因此这些谷类 也含有麸质。麸质使面团具有坚固的结构。在面包加工时的醒发过程中麸质蛋 白形成网状结构,如果没有麸质就不能形成这样的结构,面包也就不能发酵。对 于大多数人来说麸质是很普通的蛋白质,容易被胃肠道消化。然而少部分人却 不能消化麸质蛋白。这些人有麸质蛋白不适应症——最常见的病症是乳糜泻。 麸质是一系列单一蛋白质的混合物,这些蛋白质可被划分为两组——醇溶谷蛋 白和谷蛋白。主要的醇溶谷蛋白,也就是麸朊,似乎是乳糜泻或麸质蛋白不适 应症的主要原因,通常在患有这种病症的免疫体中能够发现麸朊抗体。患有这 种疾病的人食用含有麸质蛋白的食物时,他们的免疫系统就会通过损害小肠来 做出反应。特别是对小肠内层的茸毛的破坏。食物中的营养成分都是经过这些 茸毛被吸收并进入血液循环的,没有它们的帮助,不管吃进去多少食物,人都 会营养不良。因为人体自身免疫系统造成的损害,乳糜泻被认为是自身免疫功 能紊乱,也可以看作是一种吸收障碍性疾病,因为营养物质不能被吸收。乳糜 泻还被称为自发性吸收不良综合症、非热带性口炎性腹泻和谷蛋白敏感性肠病。 该疾病无法治愈,但避免食用麸质可以消除其症状,减轻并可能逆转其损害, 并降低相关的健康风险。为了确保患有乳糜泻的人获得应有的警示和不被误导, 以及为食品的“无麸质”类标签的使用提供真实和准确的信息,准确严格的检 验方法是必不可少的。

目前针对食品致敏原的检测方法,主要有体内检测的皮肤试验和双盲安慰 剂对照激发试验,体外检测的血清I,试验和组胺释放试验、PCR检测等。传 统的体内检测试验直接检测是否存在过敏蛋白质,由于过敏蛋白质通常痕量存 在而被食品基质掩盖,造成试验结果假阴性。DNA比蛋白质更耐受热处理和压 力作用,尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体。PCR方法中,在热 变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白提取时受食物基质的影响较大, 它的另一个优点是稳定性,不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响。 但是常规的PCR特异性较低,且存在污染问题。

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,它通过 在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程。由于该技 术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异准 确、可有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已广泛应用于各种 基因的检测。

发明内容

本发明的目的即在于提供方便、快速、灵敏地定量检测食品中致敏性麸质 成分的实时荧光PCR方法,以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列的 试剂盒。

为实现上述目的,本发明首先提供食品中四种致敏原麸质成分实时荧光 PCR检测引物和探针,它们分别是:

①大麦(Barley)Hordein基因的检测引物和探针序列:

正向引物(SEQ ID NO.1):5′-AACAGCTAAACCCATGCAAGGTA-3′,

反向引物(SEQ ID NO.2):5′-GTTCGGGGATTTGGGGTAGTTG-3′,

探针(SEQ ID NO.3):

5′-FAM-TCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCT-Eclipse-3′;

②小麦(Wheat)Gliadin基因的检测引物和探针序列:

正向引物(SEQ ID NO.4):5′-CCCAAAGTACGACGCAACGAC-3′,

反向引物(SEQ ID NO.5):5′-GGATTCGGTTATGCCTTCGTG-3′,

探针(SEQ ID NO.6):

5′-FAM-CATGCCGACACACATCAAGGTTGAC-Eclipse-3′;

③黑麦(Rye)Sec1基因的检测引物和探针序列:

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