[发明专利]食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品致敏性成分的基因检测方法。尤其是食品致敏原虾成分的 实时荧光PCR检测方法及其中所涉及的特异性引物、探针和相关试剂盒。

背景技术

研究表明，发达国家对食物过敏反应的人群约占3.5～5％，这些过敏性人群 即使摄入含微量过敏源的食物，也会产生很严重的过敏性反应，甚至致命。此 外，乳糖和小麦蛋白的耐受量也值得过敏性人群的关注。过敏性人群必须避免 含有相关过敏源或超过耐受限量的食物，因此，必须对任何含有潜在致敏反应 的食物进行合理的标识。欧盟关于食品配料标签要求的2003/89/EC指令规定， 任何含有该指令所涉及的过敏源的产品必须标识。该指令列出了所有过敏源食 物，包括任何含有或源自谷物(肤朊/小麦蛋白)、甲壳类动物、鸡蛋、鱼类、 花生、大豆、乳及乳制品(包括乳糖)、坚果(榛子、杏仁、巴西坚果、腰果、 开心果、胡桃、美洲山核桃、澳大利亚坚果、昆士兰坚果)、芝麻、芹菜、虾 及硫酸盐；此外，欧盟06年新增了羽扇豆(Lupin)和软体动物(mollusa)作为新的 过敏源(欧盟2006/142EC号指令)。虾含有多种复杂致敏成分，蛋白是虾主要的 致敏成分。其食用致敏症状主要表现为产生不同程度的皮肤过敏现象，如浑身 发痒和红斑等症状。过敏性疾病无法治愈，但避免食用含过敏原的食物可以消 除其症状，减轻并可能逆转其损害，并降低相关的健康风险。为了确保过敏患 者获得应有的警示和不被误导，以及为规范监督食品标签的使用提供真实和准 确的信息，准确严格的检验方法是必不可少的。因此有必要建立针对虾过敏原 准确、严格、灵敏的检验方法。

目前针对食品致敏原的检测方法，主要有体内检测的皮肤试验和双盲安慰 剂对照激发试验，体外检测的血清IgE试验和组胺释放试验、PCR检测等。传 统的体内检测试验直接检测是否存在过敏蛋白质，由于过敏蛋白质通常痕量存 在而被食品基质掩盖，造成试验结果假阴性。DNA比蛋白质更耐受热处理和压 力作用，尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体。PCR方法中，在热 变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白提取时受食物基质的影响较大， 它的另一个优点是稳定性，不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响。 但是常规的PCR特异性较实时荧光PCR低，且存在污染问题。

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它通过 在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程。由于该技 术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异准 确、可有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已广泛应用于各种 基因的检测。

发明内容

本发明的目的即在于提供方便、快速、灵敏地定量检测食品中致敏性虾成 分的实时荧光PCR方法，以及检测中所使用的包含特异性引物及探针序列的试 剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供食品致敏原虾成分实时荧光PCR检测引 物和探针，它们分别是：

①虾16S rRNA基因I的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：

5′-GATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGCG-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-TAAAGGTCGAACAGACCTTCTCACT-3′，

探针(SEQ ID NO.3)：

5′-FAM-CTTCCTTGAAAGTTCATATCGACAGGAAGGG-Eclipse-3′；

②虾16S rRNA基因II的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.4)：5′-AAGTCTAGCCTGCCCACTG-3′，

反向引物(SEQ ID NO.5)：5′-GTCCAACCATTCATACAAGCC-3′，

探针(SEQ ID NO.6)：

5′-FAM-AGACTAATGATTATGCTACCTTCGCACGGTC-Eclipse-3′；

③北极虾16S rRNA基因的检测引物和探针序列：

正向引物(SEQ ID NO.7)：5′-ATTAAGTTACTTTAGGGATAACAGC-3′，

反向引物(SEQ ID NO.8)：5′-ACCTTAATTCAACATCGAGGTC-3′，