[发明专利]一种可同时检测人线粒体细胞色素b基因12个位点多态性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测人线粒体cytb基因12个位点多态性的方法，属于基因工程领域。

背景技术

随着人类基因组测序计划的完成，人类已进入后基因组时代。该时代的研究重点是个体间的遗传差异。这种差异最常见的是单核苷酸多态性(SNP)，即在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。这种多态性是决定人类疾病易感性的主要因素。

细胞色素(Cytochrome，Cyt)是一类含有铁卟啉辅基的色蛋白，属于递电子体。Cytb基因(Cytochrome b，Cytb)是线粒体上14747-15887的区域，是细胞色素的一种。Cytb基因表达相应蛋白横贯膜两侧，是极端疏水性蛋白，和c₁是辅酶Q-细胞色素c还原体系中的两个带氧化还原中心的组分(参见图1)。

线粒体内膜中除Cytb外，还有c1、c、aa3，肝、肾等组织的微粒体中有细胞色素P450(P450也是一种b类细胞色素，辅基为原血红素IX)。细胞色素b、c1、c为红色细胞素，细胞色素aa3为绿色细胞素。铁原子的第5、6个配位键被组氨酸咪唑基的氮原子和甲硫氨酸的硫原子所占据，因而还原型的细胞色素c不能被氧直接氧化。在呼吸链中铁硫蛋白多与黄素蛋白或cytb结合存在。铁硫蛋白中的铁可以呈两价(还原型)，也可呈三价(氧化型)，由于铁的氧化、还原而达到传递电子作用。有研究(Blakely EL，Mitchell AL，Fisher N，et.al.A mitochondrial cytochrome b mutation causing severe respiratory chain enzymedeficiency in humans and yeast.FEBS J.2005，272(14)：3583-3592)发现Cytb突变会引起严重的氧化呼吸链酶缺乏，引起氧化呼吸链复合体功能不良。

线粒体肌病常由基因突变直接影响线粒体电子传递链功能引起的，由于病理原因诱导突变影响线粒体功能，其发病率约为1/8000，诊断方法常需要有乳酸盐和丙酮酸盐，尿有机酸，磁共振，肌肉组织和亚结构，酶学，遗传学分析和运动训练测试等方法辅助。常见的训练不耐受(Exercise intolerance)是线粒体肌病的前兆，肌肉组织电子传递链功能紊乱常出现代偿性无氧代谢增加(乳酸生成，磷酸肌酸降解)，电子传递链自由基生成增加，ETC中电子传递和氧摄取减少，线粒体增殖减少。由于线粒体在体内广泛分布因此多器官涉及此过程。训练不耐受是常见的但易被忽视线粒体肌病的发病指标(TarnopolskyMA，Raha S.Mitochondrial myopathies：diagnosis，exercise intolerance，andtreatment options.Med Sci Sports Exerc.2005，37(12)：2086-93)。许多研究Cytb突变与运动训练不耐受(Exercise intolerance)有密切关联，并可能是肌病的发病的潜因(Andreu AL et al..Exercise intolerance due to mutatiohs in the cytochrome b geneof mitochondrial DNA.N Engl J Med.1999；341(14)：1037-1044；Andreu AL，et al..Anonsense mutation(G15059A)in the cytochrome b gene in a patient with exerciseintolerance and myoglobinuria.Ann Neurol.1999，45(1)：127-30；Andreu AL，et al..Polymorphic variants in the human mitochondrial cytochrome b gene.Mol Genet Metab.1999，67(1)：49-52.)；但直到目前，对cytb在电子传递链中的复杂功能至今还不清楚，但是在Cybt的SNP研究中，据对www.mitomap.org注册位点信息的查询中发现，cytb基因上SNP位点的突变与许多肌病和运动不耐受相关，因此我们推测，由于Cytb与肌肉能量代谢有重要关系，因此在运动过程中，可能因人而异，与运动能力与效果有关。