[发明专利]小分子RNA的调控位点及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及小分子的调控位点，通过对调控位点的改变，能够控制基因的表达。

技术背景：

miRNA和siRNA的研究是近年来国际生命科学研究的热点之一。具有调节功能的非编码小分子RNA是指长度为21-24nt左右，大多在进化上具有序列保守性的RNA分子。它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式，在转录后水平上通过降解mRNA或抑制其翻译，参与调节真核生物染色体结构的维持、防御病毒及调控生长发育等过程。小分子RNA的发现不仅揭示了困扰科学家们多年的基因沉默现象的本质，还改变了人们对基因的传统认识，特别是miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破，小分子RNA在2002和2003连续两年被《Science》杂志评为“年度十大科技进展”。随着对小分子RNA研究的深入，近几年又发现有新的小分子种类，例如trans-acting siRNA(ta-siRNA)和天然顺式排列的反义RNA(natural cis-antisense RNA)介导产生的nat-siRNA参与植物的发育调控和逆境反应，这些新发现使我们认识到小分子RNA的存在可能具有更为广泛的作用。

大量的实验证据表明miRNA对动植物的多种生命现象具有重要的调控作用，在植物中主要表现在花的形态建成、开花时间的调控、维管束发育、根冠细胞的形成和叶型的发育等方面。在拟南芥中，某些miRNA的表达量在高盐及营养等逆境条件下会明显改变，表明miRNA还参与植物抗逆性反应等生理过程的调控此外，miRNA还介导反式作用的ta-siRNA的合成而间接地参与植物发育调控(Yoshikawa et al.，2005)，以miRNA390为例，miRNA390掺入到RICS复合体后可以指导TAS3转录本的切割，TAS3并不编码蛋白质，而是ta-siRNA的前体。TAS3被切割后产生固定的5’或者3’末端，经过RDR6反转录，形成双链的TAS3RNA，在DCL4的作用下，产生TAS3ta-siRNA并指导靶基因ARF3mRNA的降解。由于TAS3ta-siRNA作用的靶mRNA不是它自身编码的TAS3位点，而是以反式作用于ARF3，4mRNA，顾名思义这类siRNA为反式作用的siRNA(trans-acting siRNA)。这类新的siRNA的发现，不仅使我们认识到了miRNA的新功能，更使我们认识到小分子RNA的存在可能具有更为广泛的作用。

水稻是我国最重要的粮食作物之一，关系到我国粮食安全以及人民生活的基本保障。水稻育种一直是现代育种学家关注的焦点问题之一。在我国水稻虫害日益猖獗，但因水稻缺乏抗虫基因而只好依赖于化学杀虫剂来防治，这样就增加了稻作成本并污染了生态环境；白叶枯病是水稻三大病害之一，目前我国杂交水稻大多数组合不抗白叶枯病；稻瘟病是水稻三大病害之首，目前尚未有效果好的抗稻瘟病的基因被发现。水稻基因组测序已经完成，如何利用测序基因寻找高效的抗虫抗病基因一直是现代生物学和育种学家探索的问题。

发明内容：

本发明包含了miRNA的10个靶位点，通过突变这些靶位点可以调控基因的表达，为筛选高效的抗病抗虫基因提供了丰富的资源。

本发明所提供的miRNA的识别位点，是长度为18-24nt的脱氧核苷酸序列，这些序列具有以下特性：

1)序列表中的SEQ ID NO：1

序列表中的SEQ ID NO：1由20个脱氧核苷酸序列组成，是基因Os01g69830、Os08g41940、Os09g32944、Os06g23650被osa-miR156识别的位点，在体内osa-miR156通过识别SEQ ID NO：1位点切割，实现对Os01g69830、Os08g41940、Os09g32944、Os06g23650的调控。

2)序列表中的SEQ ID NO：2

序列表中的SEQ ID NO：2由22个脱氧核苷酸序列组成，是基因Os03g02970被osa-miR162识别的位点，在体内osa-miR162通过识别SEQ ID NO：2位点切割，实现对Os03g02970的调控。

3)序列表中的SEQ ID NO：3

序列表中的SEQ ID NO：3由21个脱氧核苷酸序列组成，是基因Os03g48970被osa-miR169识别的位点，在体内osa-miR169通过识别SEQ ID NO：3位点切割，实现对Os03g48970的调控。

4)序列表中的SEQ ID NO：4